[发明专利]克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法

权利要求书

1、克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法，其特征在于：

a、鸟枪克隆：以质粒P^IJ702为载体将经限制性内切酶Bgl II分别酶切过的米生卡链霉菌(Streptomyces mykarofaciens)总DNA和P^IJ702质粒DNA，以3～5∶1浓度比，在T4-DNA连接酶作用下，于10～14℃放置3小时以上进行连接反应，得到重组DNA分子；

b、转化：采用a步骤中连接后的重组DNA，以变铅青链霉菌TK54的原生质体为受体，用DNA转化方法将连接后的DNA转化进入所述的受体菌中；

c、挑选转化子及提取重组质粒：以含硫链丝菌素终浓度为25微克/毫升的R2琼脂平板挑选含重组质粒的转化子，在所述的含硫链丝菌R2平板上所选的白色菌落即为含重组质粒的转化子，然后采用快速碱变性方法提取含重组质粒转化子，将琼脂糖凝胶电泳后确定为重组质粒的样品再进行限制性内切酶Bgl II的酶切，酶切后的DNA片段与在同一琼脂糖凝胶电泳平板上泳动的入噬菌体DNA限制性内切酶Hind III酶切片段泳动距离进行比较，从而确定各片段分子量大小，挑选出其中质粒分子量为10.0kb，插入片段为4.16kb的NO.9重组质粒；从而得到NO.9重组质粒DNA；

d、NO.9重组质粒的转化：以螺旋霉素链霉菌为受体菌，用DNA转化方法，将该NO.9重组质粒转化进入受体菌内，使丙酰化酶基因在其中克隆和表达；

e、挑选克隆有NO.9重组质粒的转化子：在含硫链丝菌素终浓度为25微克/毫升的R2再生琼脂平板上进行挑选转化子，采用DNA转化方法进行原位杂交，以NO.9重组质粒为探针，与固定于硝酸纤维素薄膜上经过变性处理的转化子DNA进行原位杂交，从中挑选出阳性杂交结果的克隆菌株，因此，获得克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌，分类命名为StrepxomycesSpiramyca Ticus n.SP.Yan et Yu NO.61S61，保藏编号为CGMCC NO.0162。

2、按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于：对在e步骤中挑选出阳性杂交结果的克隆菌株后再进行Southern分子杂交，其中，以NO.9重组质粒为探针，将Bgl II酶切过的螺旋霉素链霉菌受体菌总DNA和NO.61克隆转化子总DNA杂交，获NO.61克隆菌株。

3、按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于：在a步骤的鸟枪克隆方法中，Bgl II酶切过的生米卡链霉菌DNA与Bgl II酶切过的P^IJ702连接时，其浓度比为5∶1。

4、按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于：在a步骤的鸟枪克隆操作中，在生米卡链霉菌无活性变株总DNA的分离方法中采用反复快速冷冻和解冻法，其中，当将离心后的湿菌丝加入含溶霉菌的saline-EDTA缓冲液后，35～37℃保温后立即于-20℃冻结，加入Tris-SDS  缓冲液后于60℃化冻，再置于-20℃冻结并再度于60℃化冻，随后进行振荡抽提。

5、按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于：在b步骤转化操作中，50微升变铅青链霉菌TK54原生质体与已连接的DNA混合进行转化时，该已连接的DNA浓度在1微克以下。

6、按照权利要求4所述的构建方法，其特征在于：在b步骤转化操作中，50微升变铅青链霉菌TK54原生质体与已连接的DNA混合进行转化时，该已连接的DNA浓度为0.5微克。

7、按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于：在d步骤NO.9重组质粒转化过程中，在加入适量玻璃珠的可溶性培养基中，在28～30℃下，一级培养40～48小时，再以10～15％接种于新鲜相同的可溶性培养基中在28～30℃下二级培养24～30小时，用以制备螺旋霉素链霉菌原生质体。

8、按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于：在d步骤NO.9重组质粒转化过程中，所用溶菌酶量为5～15毫克/毫升，在26～28℃下放置1.5～3小时，形成螺旋霉素链霉菌原生质体成球率达90％。