[发明专利]克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法

说明书

本发明涉及微生物领域。

丙酰螺旋霉素是一种新药，目前尚未用于临床，但是据药理实验初步结果看，体内外抗菌活性优于目前临床使用的乙酰螺旋霉素，目前尚无产品。当前获得丙酰螺旋霉素可以采用下列方法：

1.生物转化法：

中国医学科学院医药生物技术研究所刘若莹教授在中国专利申请号为87104407中介绍一种生物转化法，该法基本上将具有丙酰化酶活性的生米卡链霉菌变株在28℃条件下培养48小时后，于培养液中加入螺旋霉素，在菌株的丙酰化酶作用下，使螺旋霉素生物转化成为丙酰螺旋霉素。

采用上述生物转化发酵方法获得丙酰螺旋霉素时，可以减少因化学合成所造成的三废污染；可以将具有丙酰化酶活性的生米卡链霉菌制备成固相化细胞，从而提高生物转化率，有利于工业生产。但此法存在着缺点，它必须通过发酵获得螺旋霉素，才能进行生物转化，因此工艺复杂，成本较高。

2.半合成方法：

采用半合成方法使螺旋霉素4″-0丙酰化，从而获得丙酰螺旋霉素，该法需先通过发酵获得螺旋霉素后再用化学方法，在保护其它位点情况下进行半合成，因此，工艺仍很复杂，成本高，有三废污染，且目前尚无报导。

3.基因工程方法：

目前有人采用其它基因克隆路线(尚未发表)，将生米卡链霉菌的酰化酶基因克隆至螺旋霉素产生菌株中，但得到的产物成分较多，除螺旋霉素外，还有乙酰螺旋霉素和丙酰螺旋霉素以及其它酰化成份。由于多组份，为化学提取和使用均带来很大困难，从而直接影响经济效益，目前未有报导。

本发明目的在于：采用基因工程方法，构建一种可直接产生丙酰螺旋酶素的基因工程菌，只需将其一次发酵即可获得丙酰螺旋霉素产品，从而简化生产步骤，可使丙酰螺旋霉素占产物总组成的20％以上并减少生产过程中的三废污染。

本发明目的是这样达到的：将有丙酰化酶基因的重组质粒转化至螺旋霉素生产菌株，选择出所需转化子，再经原位杂交即可获得丙酰螺旋霉素基因工程菌，即克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌。

以下结合附图对本发明进行详细说明。

附图1是克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建步骤方框图；

附图2是丙酰化酶基因克隆菌株(Streptomyces lividans TK 54No.9菌株)孢子丝；

附图3是No.9重组质粒转化子的转化产物薄层层析图；

附图4是No.9重组质粒转化子的转化产物生物显迹图；

附图5是丙酰螺旋霉素高压液相色谱；

附图6是NO.9重组质粒转化子的转化产物高压液相色谱；

附图7为Southern分子杂交图；

附图8是NO.9重组质粒的限制性内切酶图谱；

附图9是原位杂交放射自显影图；

附图10是Southern分子杂交图；

附图11图No.61转化子发酵产物薄层层析图；  

附图12为NO.61转化子发酵产物生物显迹图；

附图13是丙酰螺旋霉素高压液相色谱；

附图14是NO.61转化子发酵产物高压液相色谱；

附图15是丙酰螺旋霉素质谱分析图；

附图16是NO.61转化子发酵产物质谱分析图；

附图17是丙酰螺旋霉素基因工程菌孢子丝照片；

附图18为丙酰螺旋霉素基因工程菌孢子(1×12000)；

附图19为丙酰螺旋霉素结构示意图。

附图1是本发明克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌(也称丙酰螺旋霉素基因工程菌)构建步骤方框图。