[发明专利]乙型肝炎基因工程疫苗免疫佐剂制备工艺

权利要求书

1、一种乙型肝炎基因工程疫苗免疫佐剂的制备工艺，其特征在于从传统中草药伞形科植物[AngelicaSinesis(Oliv)Diels]即ASD中分离提取ASDP及ASDE₂，为疫苗佐剂并制备成免疫刺激复合物HBsAg-ASDP-ASDE₂，作为预防用药。

2、按权利要求1所述的制备工艺，其特征在于ASD中佐剂有效组分ASDE₃的分离、提取：

a、伞形科传统中草药（Angelica  Sinensis（Oliv）  Diels，ASD），用粉碎机粉碎。

b、加95%乙醇（1-2倍体积），60℃，抽提3-4次，每次1小时。乙醇提取物合并、浓缩。乙醇提取不溶物，晾干，备用。

c、乙醇提取物加等体积乙酸乙酯，室温抽提两次，抽提物合并、浓缩。

d、乙酸乙酯提取物柱层析：（1）柱层析：100×3CM，（2）硅胶粒度范围100目，青岛海洋化工厂出品，300克，（3）样品：乙酸乙酯提取浓缩物6克，（4）洗脱液，乙酸乙酯-正己烷1∶5～1∶0（V/V），（5）洗脱液按每份100ml收集，同时用硅胶G，F254，TLC，及三用紫外分析仪，波长2537A及3650A，检测，Rf为0.5，3650A不显萤光，（6）将含有效组分ASDE₂部分，进行合并，减压浓缩纯化后，即得到单一有效组分ASDE₃的样品。

3、按权利要求1所述的制备工艺，其特征在于ASD中佐剂有效组份ASDP的分离、提取及制备：

a、ASD乙醇抽提之后的乙醇不溶物，称重。

b、加1-2倍体积的无盐水PH7.0，60℃，抽提2-3次，每次1小时，收集水提物，减压浓缩。

c、水提浓缩液，加1/10～1/2体积的氯仿-正丁醇（4∶1～9∶1），PH7，振摇，5分钟后，过滤。

d、上清液，经自来水透析过夜。

e、透析液再加2-3倍体积无水乙醇，振摇，5分钟后过滤。

f、沉淀物分次用乙醇、丙酮、乙醚洗。

g、洗后，冷冻、干燥，得ASDP样品。

4、按权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，免疫刺激复合物包括疫苗加佐剂的制备：

ASDP/ASDE₃按60/30mg/Kg配制成PH5-7的水溶液，10磅，20分钟，高压消毒后，加入无菌的哺乳动物细胞系表达的重组DNA乙肝疫苗，轻轻振荡，室温或37℃放1～2小时，冰箱过夜，备用。

5、按权利要求1所述的制备工艺，其特征在于免疫刺激复合物的制备先将ASDP处理，即ASDP100mg加入0.015M NaIO₄50ml室温pH4～6避光，低温（4℃）反应2小时，加乙二醇1～2ml，经蒸馏水透析。处理后的ASDP，再按ASDP/ASDE₃60/30mg/Kg配制后加HBsAg，再加入0.08M NaBH₄0.2-0.6ml室温，反应30分钟，蒸溜水透析过夜，透析液及新的ISCOMS，冰箱保存备用。

6、按权利要求1所述的制备工艺，其特征在于ASDP/ASDE₃有效剂量范围2-120/1-60mg/Kg，二者比例为2∶1～1∶2及ASDE有效组分（1-8）合用。