[发明专利]乙型肝炎基因工程疫苗免疫佐剂制备工艺

说明书

本发明属来源于植物的药物制品领域。

目前临床上应用的乙型肝炎疫苗免疫佐剂为氢氧化铝胶。它从30年代起始用，现已有50多年历史了。其优点：（1）对老一代疫苗（血源疫苗）其佐剂性效果较肯定;（2）毒性小;（3）生产成本不高。但也存在很多不够理想之处，半个世纪以来，各国科研工作者，从不同来源，研究了一系列疫苗新佐剂，至今尚未见报导优于氢氧化铝胶的新的疫苗佐剂，因此延用至今。七十年代起，各种新一代疫苗相继研制成功，如DNA重组疫苗、合成肽疫苗等，由于新一代疫苗的免疫原性均很低，必须与相关的疫苗佐剂合用，才能使机体产生保护性的有效的免疫应答。因此，新免疫佐剂的开发研究，就成为新一代疫苗研究的热门课题之一。

氢氧化铝胶存在的主要问题：（1）对各种新一代疫苗的免疫佐剂性差，远远不能满足各种新疫苗迅猛发展的需要;（2）氢氧化铝胶主要的质量控制指标是浊度与pH值，制备过程中难以标化，往往因批而异影响效果;（3）氢氧化铝胶与抗原（疫苗）主要是通过物理的离子吸附作用相结合，它往往受抗原的等电点，溶液的pH值及离子强度等因素的影响，使免疫佐剂性波动很大，效果重复性差;（4）机体的细胞免疫反应（CMI），在机体保护性的免疫应答中，起着十分重要的作用，而氢氧化铝胶不能诱导机体产生细胞免疫反应;（5）氢氧化铝胶，不能冷干与冷冻，对存贮与运输极为不便。

美国专利US  Patent  No4，843，067公开了一种只含多糖的免疫药品（PCI），虽然也用了ASD多糖，但其主要用来作免疫增强剂，治疗人的免疫抑制状态如老龄等，其分离提取制备方法与我们完全不一样。日本专利昭53-32107公开了ASD生物学的活性物质，即ASD多糖，只作了一般的免疫学试验。

本发明的目的是研制出了一种佐剂性效果好、毒性小，优于现用的氢氧化铝胶的乙型肝炎基因工程疫苗（HBsAg）新免疫佐剂。

本发明的主要内容为，从传统中草药伞形科植物[Angelica Sinesis（Oliv）Diels]即ASD中分离提取ASDP及ASDE₃作为疫苗佐剂，并与疫苗制备成免疫刺激复合物HBsAg-ASDP-ASDE₃。

有效组分ASDE₃的分离、提取：

1、伞形科传统中草药〔Angelica  Sinensis（Oliv）Diels，ASD〕，粉碎机粉碎。

2、加95%乙醇（1-2倍体积），60℃，抽提3-4次，每次1小时。乙醇提取物合并、浓缩。乙醇提取不溶物，晾干，备用。

3、乙醇提取物加等体积乙酸乙酯，室温抽提两次，抽提物合并、浓缩。

4、乙酸乙酯提取物柱层析：（1）柱层析：100×3CM，（2）硅胶粒粒度范围100目，青岛海洋化工厂出品，300克，（3）样品：乙酸乙酯提取浓缩物6克，（4）洗脱液，乙酸乙酯-正己烷1∶5～1∶0（V/V），（5）洗脱液按每份100ml收集，同时用硅胶G，F254，TLC，及三用紫外分析仪，波长2537A及3650A，检测，Rf为0.5，3650A不显萤光，（6）将含有效组分ASDE₃部分，进行合并，减压浓缩纯化后，即得到单一有效组分ASDE₃的样品，ASDE₃为一新化合物。

ASDP分离、提取即制备：

（1）ASD乙醇抽提之后的乙醇不溶物，称重。

（2）加1-2倍体积的无盐水，PH7.0，60℃，抽提2-3次，每次1小时，收集水提物，减压浓缩。

（3）水提浓缩液，加1/10～1/2体积的氯仿-正丁醇（4∶1～9∶1），PH7，振摇，5分钟后，过滤。

（4）上清液，经自来水透析过夜。

（5）透析液再加2-3倍体积无水乙醇，振摇，5分钟后过滤。

（6）沉淀物分次用乙醇、丙酮、乙醚洗。

（7）洗后，冷冻、干燥，得ASDP样品。

上述ASDP样品，进行了免疫药理学及化学研究，表明为一多糖类化合物。我们用作为药物载体。

含有乙型肝炎基因工程疫苗的新免疫佐剂ASDP/ASDE的制备：

HBsAg-ASDP/ASDE₃为一新的免疫刺激复合物（ISCOMS）制备方法有二：

（A）ASDP/ASDE₃按60/30mg/Kg配制成PH5-7的水溶液，10磅，20分钟，高压消毒后，加入无菌的哺乳动物细胞系表达的重组DNA乙肝疫苗，轻轻振荡，室温或37℃放1～2小时，冰箱过夜，备用。