[发明专利]桄榔植物蛋白酶的提取方法

说明书

本发明涉及一种从植物中提取新蛋白酶种的方法。

酶是生物催化剂。根据酶的来源，可分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶三类。植物蛋白酶由于资源丰富，不需要采用象微生物发酵培养之类的复杂工艺，因而受到重视。植物蛋白酶是植物组织中含有的天然物质，可以应用到食品、制革、洗涤及医药工业之类的许多领域。植物蛋白酶常常按习惯以植物“属”命名。已经提取形成生产的植物蛋白酶有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、剑麻蛋白酶等。

众所周知，不同的植物蛋白酶，具不同的性质，因而开发新的植物蛋白酶种，就可以扩大用途。如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和剑麻蛋白酶活性最适pH范围在中性，三种酶室温下在50％乙醇中失活。

本发明的目的在于采用非常规的植物蛋白酶提取方法，提取新的，具有耐乙醇和高pH值的植物蛋白酶。

本发明采用无机盐沉淀法(提取粗酶)和高pH去杂离子交换法(提取精酶)从棕榈科(Palmaceae)桄榔属(Areaga)砂糖椰子(Areaga Pinnata、又名桄榔)植物中提取桄榔蛋白酶的工艺过程顺序是：采用砂糖椰子作原料，将其榨取汁液，用硫酸铵加入汁液中去除杂蛋白，经沉淀取沉淀物干燥后得粗酶；或将粗酶用透析膜透析除盐，用碱调pH至碱性，离心后取上清液经层析后再经干燥得精酶。

本发明工艺过程所采用的砂糖椰子植物包括其茎、果柄、果皮和果肉，但以果肉的含酶量最高，在成熟度不同的果实中，又以果实充分长大，但又未成熟变软时的酶得率最多且活性最高。

本发明工艺过程用硫酸铵去除杂蛋白和沉淀时，先用25-35％饱和度硫酸铵加入榨取的桄榔汁液中去除杂蛋白，然后上清补足50％饱和硫酸铵取其沉淀。

本发明工艺过程采用碱调节pH时，所用的碱可是氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化铵、铵水，但最好是用氢氧化钠将经透析的粗酶调pH至9．5左右。

本发明工艺过程所采用DE(Diethylaminoethyl)52层析，也可用CM(Corboxymethyl cellulose)52、22，QAE(Diethyl[2hydroxyproyl]aminoethyl)25、50等柱取代进行分离，但分离效果不如DE52。

本发明经DE52柱层析酶能分离9个在280nm处有吸收的蛋白峰，其中2、4、5峰有活性，第5蛋白峰为主要活性成份。经等电聚焦鉴定DE52柱层析成份5，证实DE52层析的酶制剂较纯，等电点在pH3．99左右，将对应等电为pH3．99的位置上切下的胶体进入系统测活，显示该蛋白带有活性，证明该蛋白带确是蛋白酶。用SPS电泳证明酶的分子量为4．4万道尔顿。

采用本发明方法所得到的桄榔蛋白酶，除具有一般的巯基蛋白酶性质外，还表现出以下特性：(1)桄榔蛋白酶比菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶的巯基试剂耐受力要高出两个数量级，5×10^-3mol的Na₂S₄O₆和10^-3mol的DFP、PMSF对它的活性无影响；(2)桄榔蛋白酶极耐碱，在pH9．6-11之间有最高活性，pH13时酶活性还有pH7时的1／3；(3)桄榔蛋白酶在50-75％的乙醇(30分钟)内都显示出几乎最高活性。桄榔蛋白酶的以上特性，显示了它在生物工程中作为工具的前景。

实施例1：

剥取充分长大的桄榔果实的果肉100克压榨得57ml汁液，边搅拌边加入60ml40％饱和度的硫酸铵溶液，静置12小时后离心(4000转／分)取出上清液，在搅拌下加放固体硫酸铵。使溶液达50％硫酸铵饱和度。静置12小时。离心(10000转／分)取沉淀。加PH9．3的NaOH溶液溶解沉淀。试液用透析膜透析除盐。再用NaOH调已透析后的试液为PH9．3，离心(10000转／分)。取上清液用DE52柱层析分离。取层析成分5冷冻干燥成精酶0．37克、活力485万紫外单位／克。

实施例2：

柱层析前的操作同实施例1。取上清液用CM52柱层析分离，取层析成分1、冰冷干燥成精酶0．52克、活力为293万紫外单位／克。

实施例3：

制备过程按实施例1，将冷冻干燥改成50℃热风干燥，得精酶0．35克，活力为308万紫外单位／克。

实施例4-7：

取砂糖椰子的茎、果实柄、果皮、果肉各1000克。分别榨取汁液。用酪蛋白法直接测汁液活性。结果见表1。