[发明专利]一种枯草杆菌克隆载体及其构建

权利要求书

1、一种枯草杆菌克隆载体，由信号肽区域5、前肽区域2和成熟酶区域4构成，其特征在于，其前肽区域2内插入含切点B、X、S、P、Sp和H多克隆位点的DNA片段(36bp)9，是一种利用枯草杆菌自身(内源的指示基因构建而成的、具有重组体筛选标记的枯草杆菌克隆载体。

2、按权利要求1所述的枯草杆菌克隆载体，其特征在于，其构建方法包括：

（1）把含有中性蛋白酶基因的质粒DNA与限制性内切酶MstⅠ混和，在37℃的条件下，保温45～90分钟，使其彻底酶解，再在65℃的条件下，保温10～15分钟，使酶解反应中止;

（2）往（1）步骤产物里加入Bam HⅠ连接子（Linker）和T₄连接酶，把MstⅠ切点6转换成单一的Bam HⅠ切点;

（3）往（2）步骤产物里加入限制性内切酶Bam  HⅠ和Hind  Ⅲ。反应在37℃的条件下进行，使连接物彻底酶解;

（4）用凝胶电泳法去除中性蛋白酶基因的前肽区域2上的MstⅠ-HindⅢ片段8，分离纯化带有中性蛋白酶前肽顺序的大片段;

（5）用Bam HⅠ和HindⅢ同时消化pUC₁，质粒DNA，使其释放含有Ba HⅠ、X baⅠ、SalⅠ、PstⅠ、SphⅠ和HindⅢ多克隆位点的DNA片段（36pb）9;

（6）把（4）步骤和（5）步骤的产物按1∶10的比例混和，加入T₄连接酶，使带有多克隆位点的DNA片段（36bp）9连接到中性蛋白酶基因的前肽区域2的BamHⅠ-HindⅢ位点上;

（7）用（6）步骤的产物转化枯草杆菌（如DB403），在含有卡那霉素（5微克/毫升）和1%脱脂奶粉的营养平板上筛选出重组转化子，即得到本枯草杆菌克隆载体pNC₃。