[发明专利]一种枯草杆菌克隆载体及其构建

说明书

本发明涉及一种枯草杆菌克隆载体及其构建，属生物工程技术领域。

已有的枯草杆菌克隆载体，大部分没有重组体筛选标记，少部分虽有筛选标记，但只能通过间接筛选才能区分重组体和非重组体。有人曾为枯草杆菌引入类似大肠杆菌的Lac    Z指示基因的外源指示基因，旨在构建具有重组体筛选标记的枯草杆菌克隆载体，结果因异源基因不易表达或不稳定而未能达到预期的目的。

本发明的目的是提供一种利用枯草杆菌自身（内源）的指示基因构建成的、具有重组体筛选标记的枯草杆菌克隆载体。本发明的另一个目的是提供构建该枯草杆菌克隆载体的方法。

图1为枯草杆菌中性蛋白酶基因（npr    E）结构示意图，其中1为启动子（promoter），箭头方向表示转录方向自左至右;2为前肽区域（pro-peptide）;3为Eco    RI切点;4为成熟酶区域（mature    enzyme）;5为信号肽区域（signal    peptide）。图2为在前肽区域2中去除MstⅠ-HindⅢ片段的示意图，其中6为MstⅠ切点;7为HindⅢ切点;8为MstⅠ-HindⅢ片段。图3为在前肽区域2中插入带有多克隆位点（multiple    cloning    sites，MCS）的DNA片段的示意图，其中9为带有多克隆位点的DNA片段（36bp），内含切点B（BamHⅠ）、X（XbaⅠ）、S（SalⅠ）、P（pstⅠ）、Sp（SphⅠ）和H（HindⅢ）。

现结合附图说明本发明的内容。

枯草杆菌有一种外分泌蛋白酶叫中性蛋白酶（Npr    E），其基因（npr    E）由三部分组成：信号肽区域5，前肽区域2和成熟酶区域4，见图1。中性蛋白酶基因是枯草杆菌自身（内源）的指示基因，可作重组体筛选标记。中性蛋白酶基因的前肽区域2具有可缩性（flexibility），即在该区域内作人为修饰，去除部分前肽区域2或在前肽区域2中插入带有多克隆位点的DNA片段，中性蛋白酶的活性不会遭到破坏。本发明就是利用枯草杆菌中性蛋白酶基因作指示基因和前肽区域2具有可缩性作出的。

图3示出了本发明产品，枯草杆菌克隆载体的结构。与中性蛋白酶基因的结构相比，其前肽区域2中插入一段含切点B、X、S、P、Sp和H的多克隆位点的DNA片段（36bp）9，其余部分与中性蛋白酶基因的结构完全相同，见图1和图3。本枯草杆菌克隆载体命名为pNC₃。

本枯草杆菌克隆载体pNC，的构建方法包括：

（1）把含有中性蛋白酶基因的质粒DNA与限制性内切酶MstⅠ混和，在37℃的条件下，保温45～90分钟，使其彻底酶解，再在65℃的条件下，保温10～15分钟，使酶解反应中止;

（2）往（1）步骤产物里加入Bam HⅠ连接子（Linker）和T₄连接酶，把MstⅠ切点6转换成单一的Bam HⅠ切点;

（3）往（2）步骤产物里加入限制性内切酶Bam    HⅠ和HindⅢ，反应在37℃的条件下进行，使连接物彻底酶解;

（4）用凝胶电泳法去除中性蛋白酶基因的前肽区域2上的MstⅠ-HindⅢ片段8，分离纯化带有中性蛋白酶前肽顺序的大片段;

（5）用Bam HⅠ和HindⅢ同时消化pUC₁，质粒DNA，使其释放含有Ba HⅠ、X baⅠ、SalⅠ、PstⅠ、SphⅠ和HindⅢ多克隆位点的DNA片段（36pb）9;

（6）把（4）步骤和（5）步骤的产物按1∶10的比例混和，加入T₄连接酶，使带有多克隆位点的DNA片段（36bp）9连接到中性蛋白酶基因的前肽区域2的Bam HⅠ-HindⅢ位点上;

（7）用（6）步骤的产物转化枯草杆菌（如DB403），在含有卡那霉素（5微克/毫升）和1%脱脂奶粉的营养平板上筛选出重组转化子，即得到本枯草杆菌克隆载体pNC₃。

本发明与已有技术相比，具有下列优点：

1。用本发明构建的枯草杆菌克隆载体pNC₃来克隆外源基因，能直接筛选出重组体，这是迄今为止已有的枯草杆菌克隆载体所做不到的。

2。利用中性蛋白酶基因作指示基因，有易于检测（一般半定量测定只要在培养基中加入0。5～1%的脱脂奶粉）和蛋白酶的底物成本低（比β-gal的底物X-gal及所需诱导物IPIG的成本至少低几百倍）的优点。

3。由于中性蛋白酶为外分泌蛋白酶，所以本枯草杆菌克隆载体pNC，特别适用于研究生物工程中的蛋白质分泌机制。

本枯草杆菌克隆载体pNC₃可用于枯草杆菌基因工程基础研究，可作表达载体，表达融合型真核生物基因产物，可作分泌载体，以获得单一的基因产物，此外，还可用于筛选“蛋白质分泌衰减顺序”，研究蛋白质分泌机制，是一种应用前景极为宽广的分子生物学研究工具。