[发明专利]A-C-B胰岛素原，其生产方法和应用，以及胰岛素生产中的中间体

说明书

对糖尿病的广泛研究，已使胰岛素成为所有蛋白质分子中最熟悉的一种。因此，在探测高级蛋白质结构和功能的初级结构变化的影响时，胰岛素已成为优选基质。重组体DNA技术有助于产生SAR类似物的新胰岛素以及治疗应用。这些变化的归类结果有希望揭示控制初级和高级蛋白质结构之间关系的规则。然而，初级结构的这种变化很少涉及天然顺序。而且，天然顺序的这种有限转换对存在的更多途径几乎没有什么了解。

生物化学研究目的是要合成具有选定功能的分子，而不是希望发现具有所要性能的天然存在的化合物。尽管有明显的进步，但现有技术基本上没有得到初级结构与天然存在对应物明显不同的合成类似物实例。本发明使用了很有特征的胰岛素分子以着手研制合成胰岛素原类似物，该胰岛素原的结构和物理性质与天然存在的胰岛素原分子和公知的胰岛素原类似物明显不同。

胰岛素是一种含有二个亚单位多肽的蛋白质，该多肽通常被认为A-链和B-链通过二硫化物键共价交叉连接。人的胰岛素（一种胰岛素结构的典型例子）简图如图29所示。现有技术中生产胰岛素的生化途径是众所周知的，在本文一般参考文献中均可知道（参阅如，Stryer，L.，Biochemistry，2nd.Ed.，1981，W.H.Freeman&  co.，San  Francisco，pp.847-848）.体内天然存在的产生胰岛素的生化途径是通过前胰岛素原和胰岛素原中间体。

胰岛素是通过胰岛素原的表达，然后通过酶处理而重组产生的。胰岛素原，胰岛素的直接前身，是一种单链蛋白。双链胰岛素分子是通过切除胰岛素原内区，通常指C-区或C-肽而产生的。形成链内和链间二硫化物交叉键合后，内在的多肽顺序（C-肽）通过胰蛋白酶和羧肽B酶的作用而切除，生成功能性胰岛素分子。

胰岛素原基因转译顺序为B-链/C-肽/A-链氨基酸。由于重组体胰岛素生产是由胰岛素原开始而不是由前胰岛素原分子开始的，重组体胰岛素原分子在其氨基末端特征地具有一个蛋氨酸残基。因此，由胰岛素原N-末端衍生的这种Met是携带通过并留在胰岛素B-链的氨基末端。该蛋氨酸残基本质上不能被细菌宿主细胞所去除。因此，必须在体外用化学或酶促法除去这种N-末端蛋氨酸以得到天然胰岛素原或胰岛素分子。

蛋氨酰氨基态酶（MAP）（一种自然的大肠杆菌（E.Coli）蛋白）的作用可除去N-末端脱甲酰的蛋氨酸，而所提供的第二残基不是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸或蛋氨酸。胰岛素分子（图29所示的人胰岛素是一个典型例子）的初级结构检测结果表明相当于天然胰岛素原的N-末端残基的B链的N-端残基是苯丙氨酸。这种转录和转译顺序可阻止通过MAP除去产生胰岛素原分子的重组大肠杆菌的N-末端蛋氨酸。可是，A-链的N-端氨基酸是甘氨酸，甘氨酸的存在不会抑止MAP的作用。因此，若人们能将转译顺序由B-链/C-肽/A-链变成A-链/C-肽/B-链，则MAP的固有作用可除去N-端蛋氨酸。这必然可排除后转译去除N一端Met的必要，从而具有明显的工业和工艺优点。

本发明提供一种功能性胰岛素分子或胰岛素类似物的生产方法，它包括新的原料和中间体。这种新途径是通过将胰岛素原的编码顺序从B-链/C-肽/A-链变为A-链/C-肽/B-链而形成的一种胰岛素前身而进行的。形成的新型胰岛素前身消除了后转译化学或酶除去重组体胰岛素分子的N一端蛋氨酸的必要性。本发明还提供了新型的胰岛素前身中间体，在产生胰岛素的人体工程生物合成途径中它构成主要成份。这些新型的胰岛素前身具有：（a）比天然存在的胰岛素原更大的类胰岛素活性，（b）相对于天然胰岛素原的胰岛素特性来说在体内有更长的半寿命，（c）与天然胰岛素原相比，表明有更强的与IGF-I受体结合能力。本发明还揭示了从这种新分子的研究和设计中所看到的局限性，特别是对C-肽来说，它对类胰岛素原和胰岛素分子的设计是有益的。

附图中所示的限制性位点和功能图是本文所讨论的重组体DNA载体的近似代表。限制性位点的资料不完全;因此在载体中特定类型的限制性位点比图中所示的更多。

图1-质粒pKC283的限制性位点和功能图。

图2-质粒pKC283PX的限制性位点和功能图。

图3-质粒pKC283-L限制性位点和功能图。

图4-质粒pKC283-LB的限制性位点和功能图。

图5-质粒pKC283-PRS的限制性位点和功能图。

图6-质粒pL32的限制性位点和功能图。

图7-质粒pNM789的限制性位点和功能图。