[发明专利]编码白树种子储藏蛋白的合成基因的生产方法

权利要求书

1．一种编码白树种子储藏蛋白的合成基因的生产方法，其特征在于，包括下列步骤：

设计含白树种子储藏蛋白编码顺序的第一DNA片段，所述的顺序含有在白树种子储藏蛋白顺序中每种氨基酸所对应的三联密码子，所述的三联密码子选自一组能最大表达、操作或使DNA片段在表达载体中稳定的，编码各种氨基酸的三联密码子，

合成该第一DNA片段和合成所述第一DNA片段的互补DNA片段；其中，该合成步骤包括：把所述DNA片段分成一组低聚核苷酸单链重叠片段，所述片段被化学地合成，然后纯化所述的低聚核苷酸，在5′端磷酸化所述的低聚核苷酸；

且通过对所述第一DNA片段和互补DNA片段退火形成DNA双链。

2．如权利要求1所述的方法，其特征在于旁侧顺序是与所述双链DNA连在一起的。

3．如权利要求1所述的方法，其特征在于进一步包括向所述合成基因或旁侧顺序中引入限制性核酸内切酶识别位。

4．一种将权利要求1中的合成基因克隆入表达载体的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(a)酶切编码基因的双链DNA基因成线性双链状态；

(b)用限制性内切酶酶切表达载体；

(c)把所述含基因的线性双链DNA与所述表达载体连接在一起；并

(d)把步骤(c)的DNA转入宿主细胞中。

5．一种表达和纯化如权利要求1中所述的蛋白质的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(a)把基因克隆入表达载体；

(b)将表达载体转入宿主细胞；

(c)在诱导合成适当数量的基因产物条件下，培养含被克隆入表达载体的基因的宿主细胞；

(d)纯化来自于所述细胞的蛋白质。

6．如权利要求5所述的方法，其特征在于进一步包括用SDS胶电泳、Western blot分析和活性检测手段检测基因产物的方法。

7．如权利要求1所述的方法，其特征在于选择能在细菌宿主中表达的三联密码子。

8．如权利要求7所述的方法，其特征在于所述宿主是大肠杆菌。

9．如权利要求1所述的方法，其特征在于选择能在真菌宿主中表达的三联密码子。

10．如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的宿主是酵母。

11．如权利要求1所述的方法，其特征在于选择能在哺乳细胞中表达的密码子。

12．如权利要求1所述的方法，其特征在于选择能在昆虫细胞中的表达的密码子。

13．如权利要求1所述的方法，其特征在于选择能在植物细胞中表达的密码子。

14．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所有的低聚核苷酸在一个反应混和物中一起退火来组装基因。

15．如权利要求1所述的方法，其特征在于，低聚核苷酸分批退火，随后这些被一起退火并一起连接形成完整的基因。

16．如权利要求1所述的方法，其特征在于白树种子储藏蛋白基因由含有下列步骤的固相组合方法构建：

a．把一合成低聚核苷酸在或靠近它的一端处与固相载体物质结合；

b．冲洗掉多余的非结合的低聚核苷酸；

c．加入摩尔过量的低聚核苷酸，此低聚核苷酸与结合于载体上的低聚核苷酸，在其全部或部分长度上，碱基顺序完全互补，并把链一起退火产生双链DNA结构，然后冲洗掉过量的非结合的低聚核苷酸；

d．重复步骤C直到整个基因组成；

e．用DNA连接酶处理组成的基因以形成完整的双链DNA；并

f．用限制性核酸内切酶或其他适当的方法使合成基因从载体中释放。