[发明专利]编码白树种子储藏蛋白的合成基因的生产方法

说明书

本发明主要涉及免疫毒素白树种子储藏蛋白(gelonin)，具体地说涉及白树种子储藏蛋白分子生物学，包括人工合成白树种子储藏蛋白基因的方法。

人们目前对细胞毒性感兴趣在于它们可能用来特定地作用于靶肿瘤细胞。植物毒素白树种子储藏蛋白就是这样一类物质。白树种子储藏蛋白是一种(分子量约20～30,000千道尔顿)糖蛋白，从多叶白树(Gelonium multifoum)的种子纯化而得到。它属于一类能使核糖体失活的植物毒素。这类毒素的其它成员包括红豆因、蓖麻毒素和modeccin的链。象红豆因和蓖麻毒一样，白树种子储藏蛋白通过破坏哺乳动物核糖体的60S亚基而抑制蛋白质合成。尽管蓖麻毒的A链是常用的免疫毒素，但白树种子储藏蛋白对化学和物理处理似乎比RTA更稳定(Barbieri等著的《Cancer Surv.1》489-520页(1982))。另外，白树种子储藏蛋白本身不与细胞结合，所以不具有毒性(除非浓度很高)，并且在实验室的操作中很安全。核糖体的失活是不可逆的，其作用似乎不需要辅因子参与，并且效率较高，这提示白树种子储藏蛋白可以象酶一样起作用。

白树种子储藏蛋白和红豆因是抑制蛋白质合成的最有效毒素。白树种子储藏蛋白的抑制蛋白合成的活力比红豆因A链高10～1000倍。红豆因和蓖麻毒这样的肽由两条链组成，A链是毒性单位，B链与细胞结合。与红豆因和蓖麻毒不同，白树种子储藏蛋白由单链组成，并且由于它没有一与细胞结合的B链，所以相对来说其本身对完整细胞没有毒性(Stripe等著，J.Biol.Chem.255:6947-6953页(1980))。哺乳动物的细胞显然不能与白树种子储藏蛋白分子结合和/或使其进入细胞。白树种子储藏蛋白与靶肿瘤细胞的单克隆抗体的连接，与如针对黑素瘤细胞上抗原的单克隆抗体ZME连接可以使白树种子储藏蛋白特定地与细胞结合并进入使白树种子储藏蛋白抗体复合物进入细胞。用毒素白树种子储藏蛋白而不用其它毒素如红豆因A链其优点在于与红豆因A链相比，白树种子储藏蛋白对正常组织的毒性较低。与针对相关抗肿瘤抗原的单克隆抗体结合白树种子储藏蛋白是一种可选择用于治疗肿瘤的有效的免疫毒性剂。

几个研究者将白树种子储藏蛋白作为细胞毒性剂，用化学的方法使其与单克隆抗体或肽激素的细胞靶配位体相连接。但对白树种子储藏蛋白和细胞靶点的化学修饰会减少有效定位和白树种子储藏蛋白本身的胞毒潜力。而自然来源的白树种子储藏蛋白，其细胞毒性在收获过程中和在植物生长时又受到影响。用化学方法或重组技术生产的人工合成的白树种子储藏蛋白毒素可提供充足的、可再生的毒素来源。所以，用重组技术来制备一种白树种子储藏蛋白的合成基因和制备合成基因的方法是非常必要的。

本发明提供了白树种子储藏蛋白合成基因的核苷酸顺序和它的制备方法。白树种子储藏蛋白合成基因的DNA(脱氧核糖核酸)顺序在顺序编号1中给出。本发明也提供了含这些DNA顺序的表达载体和这些表达载体转化后的细胞。

本发明的一个实施例提供了生产克隆和表达编码白树种子储藏蛋白的合成基因方法。首先；设计编码来源于纯化的白树种子储藏蛋白最初氨基酸顺序的双链DNA片段，氨基酸顺序改造这个DNA片段使其有利于基因的合成、克隆、表达或生物化学操作。接着，设计、合成、纯化能连在一起形成目的基因的一组合成寡聚核苷酸(也叫低聚核苷酸)并使其5′磷酸化。接着，这些寡聚核苷酸退火后连接形成完整的基因。合成基因与一适当克隆载体连接，并测出克隆基因的核苷酸顺序。进行定点诱变以纠正克隆基因中所有不希望的突变之后，基因被亚克隆入适当的表达载体中。含合成白树种子储藏蛋白基因的表达载体被放入适当的载体宿主中，然后在适于生产白树种子储藏蛋白产品的条件下保存表达宿主，并从表达该基因的细胞中分离、纯化白树种子储藏蛋白蛋白质。

本发明的另一实施例提供了含有核苷酸和片段及其衍生物的序列的合成DNA，它编码的Selonin或多肽抑止细胞内蛋白质的合成而又不与细胞表面的受体结合，其核苷酸顺序是见顺序编号1。同时也提供了带有合成白树种子储藏蛋白DNA的表达载体及带有表达合成白树种子储藏蛋白基因的宿主细胞。

本发明的还有一个实施例提供了植物毒性蛋白白树种子储藏蛋白与抗体结合而形成的一种免疫毒素。

从本发明目的出发，术语“片段”是指顺序编号1中的任何能产生抑制细胞蛋白质合成但不与表面受体相结合的蛋白质的部份。“衍生物”是指含有替换的一种或多种单个核酸，它们产生同样的蛋白质或多肽。