[发明专利]蛋白制品中利凡诺残留量的检测方法

说明书

本发明涉及的是一种以分光光度法为基础对蛋白制品，特别是白蛋白制品中利凡诺残留含量的检测方法。

各种蛋白制品在医疗中是被大量使用的。采用利凡诺法分离制备蛋白制品，尤其是各种白蛋白制品，简单、方便、收率高，并可对废血加以有效利用。但由于其所用的利凡诺为对人体有一定毒性的吖啶类化合物，因此对利凡诺在蛋白制品中残留量的检测和控制长期以来一直为人们所关注，并为探索更简单、准确的理想检测方法仍在不断努力。其重要的原因之一就在于对蛋白制品中利凡诺含量检测的困难除其本身性质不稳定，受光照极易分解外，主要还在于其残留量已属于极低的痕量范围，制品中的大量蛋白成分对检测的干扰影响大，因而难于准确定量检测。例如在目前对蛋白制品中利凡诺残留量的各种检测方法中，《药学通报》1985（8）中介绍了醚提-紫外荧光法;《输血及血液》1977（1）介绍了乙醇沉淀-比色法等方法，其共同之处在于均需先从制品中分离提取出利凡诺，以排除蛋白成分的干扰。这种分离操作除费时、烦琐外，对含量本已极微的利凡诺而言其检测误差的影响是显然的，因而检测的重复性差，均属限量检测。《分析测试通报》1989.8（6）中介绍了一种荧光比色法，属于目视比色，检测的准确性会受人员、环境等因素影响，属半定量的分析方法。日本《药学杂志》Vol.97（1977）介绍的快速液相层析法，以及其它如荧光分光光度法等方法除需用专门仪器外，也同样要有为消除蛋白成分干扰影响的分离操作。

分光光度法是一种可用于定量的常用检测方法。但由此类蛋白制品的普通分光光度吸收光谱可见，虽然在269.5及364nm等波长处利凡诺均可有较大的吸收，但蛋白成分同时也存在较大的干扰吸收，因此无法直接进行定量检测。近年来以分光光度法为基础发展起来的导数分光光度法由于在处理多组分和/或强弱吸收相互重叠及消除背景干扰等方面具有的独特优点，正在被深入研究并在迅速发展。

本发明的目的在于提供一种采用导数分光光度法原理对蛋白制品中利凡诺残留量的检测方法。

由导数分光光度法的特性可知，随着被测对象中各组分之间的相互影响不同，可以选用适合的不同阶数的导数分光光谱进行分析，并且各阶导数的分光光谱曲线的振幅D与被测组分的浓度C之间总存在某种正比关系的函数D＝f（C），因而可用于定量检测分析。由利凡诺及蛋白成分通常的分光吸收光谱（即零阶导数光谱）可以看出，在利凡诺有较大吸收峰的330～390nm波长范围内，蛋白成分的吸收曲线基本呈线性（如图1），因此本发明方法确定选用此波长范围的一阶导数分光光度法进行检测。由此波长范围内的相应一阶导数分光光谱（如图2）可见，在利凡诺谱线的一个振幅范围内，蛋白成分的谱线可有一段呈直线的区间，且一般多呈与零线趋于平行的状态，此段波长区间即为本发明方法所依赖的基础。首先用蛋白对照液精密配制利凡诺不同含量的混合标准品，并分别测绘出其330～390nm波长范围内的一阶导数的分光光谱。在各光谱的上述蛋白成分一阶光谱呈直线，且最好为趋于与零线相平行的波长区间内任意选定两个波长λ1和λ2，并应使在各混合标准品的光谱上所选定的λ1和λ2分别保持一致。由与各混合标准品的利凡诺导数光谱中的λ1和λ2相对应的△A1和△A2之差值D及该光谱所示的利凡诺含量C即可得到表示其D＝f（C）关系的回归方程D＝aC+b。此时将待测蛋白制品在同样条件下的该λ1和λ2处的相应△A1和△A2之差值D代入该回归方程，即可定量检测出该制品中的利凡诺残留含量。

选择上述λ1和λ2时，在可能的情况下尽量增大其间的波长距离将有利于提高检测精确度。考虑到各种条件及不同仪器间的差别，实验发现该波长以λ1＝361±4和λ2＝372±4（nm）为好。

在导数分光光度法中，选用不同的波长间隔△λ所得的导数光谱对检测结果是有影响的。减小△λ可使分辨率提高，但灵敏度会相应下降，反之，△λ增大，则分辨率虽变小，但灵敏度提高。例如对本发明上述方法用△λ分别为2、3、4nm的导数光谱进行考察，结果见表1。由此可见，在本发明方法中以△λ＝3nm为佳。