[发明专利]“蛇毒凝血酶”及“去纤酶”的联产工艺

说明书

本发明属于一种制备药物的方法，尤其涉及一种用离子交换柱层析将尖吻蝮蛇（Agkistrodon  acutus）蛇毒中的两种酶药-去纤酶及止血灵（蛇毒凝血酶）同时得到的联产工艺。

Holleman，W.H.等（1976）用亲和层析自巴西矛头蝮（Bothrope  jararaca）蛇毒中分离纯化得到了蛇毒凝血酶（Hemocoagulase，Reptilase，Batroxobin，Botripase），分子量为31000。该产品为市售的止血剂（酶），日本、西班牙等从美国购买专利生产。我国每年进口数十万支，需费180万美元外汇。

本发明的任务是充分利用药源并提供一种产率高、组分纯、药效高的生产去纤酶及止血灵的联产工艺，同时生产出抗凝、溶栓及促凝、止血的两种药物。

我们在生产去纤酶的同时首先发现并分离纯化得到了尖吻蝮蛇毒凝血酶，在此之前，国内外均未发现尖吻蝮蛇毒中含有此酶。尖吻蝮蛇毒凝血（商品名止血灵）由两个同工酶组成，分子量分别为19500，30000。它们的血液活性与Hemocoagalase相似，但它们是从不同的蛇毒中纯化得到的又一新发现的蛇毒凝血酶。

我们从生产去纤维酶的同时可以生产止血灵，既充分利用药源，同时也大大提高其经济效益和社会效益，为资源综合利用提供了新的典范。而在同一药源中同时得到抗凝和促凝两种截然不同的药物也是少见的。

本发明所说的止血灵（蛇毒凝血酶）及去纤酶的联产工艺，它包括：（1）蛇毒用缓冲液溶解，离心沉淀经阴离子交换柱层析，用缓冲液洗脱，可同时得到去纤酶及止血灵粗组分;（2）将所得的去纤酶及止血灵粗组分又分别经阴离子交换剂柱层析两次以上纯化得精制的去纤酶及止血灵溶液;（3）将精制的去纤酶或止血灵溶液再经脱盐得去纤酶和止血灵原液;（4）将所得的去纤酶及止血灵原液再分别配方、过滤、分装、冷冻干燥、熔封即得注射用去纤酶及止血灵成品。其特征在于：

a.蛇毒用PH7.2-8.8缓冲液溶解，经阴离子交换剂柱层析，用PH7.2-8.8缓冲液氯化钠直线梯度洗脱可同时得到粗分的去纤酶及止血灵粗组分;

b.将所得去纤酶及止血灵粗组分再分别经阴离子交换剂两次以上层析，用PH7.2-8.8缓冲液，氯化钠直线梯度两次以上洗脱纯化得精制去纤酶及止血灵溶液;

c.粗分所得去纤酶及止血灵组分以及再纯化组分溶液不经冷冻干燥或浓缩可直接上样，全工序操作在10-20℃的无菌或半无菌室中进行。

溶解蛇毒所用的缓冲液是0.05-0.10M  Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液，粗分所用阴离子交换剂是DEAE-Sephadex  A-50或QAE-Sephadex  A-25，粗分所用氯化钠梯度为0-1.2M;纯化方法，其特征在于两次以上柱层析纯化所用阴离子交换剂是DEAE-Cellulose  DE52或DE32和DEAE-Sephadex  A-50或QAE-Sephadex  A-25;两次以上柱层析纯化洗脱所用缓冲液：去纤酶氯化钠梯度为0.1-0.8M，止血灵为0.3-0.9M。

本发明的优点为：

1.本法得率为所有蛇毒去纤酶及蛇毒凝血酶（止血灵）生产方法中得率最高，为20-30%，是国外的8-10倍。粗毒中的80-95%被分离得到，结果表明该法先进可行。

2.在一般的柱层析中，二次纯化时，其前次所得原液需经冰冻干燥或浓缩方可上样。本法则不需这样的步骤，而是将要纯化组分溶液直接上样，4×110cm²柱可上200-300ml溶液，其分离效果与冻干或浓缩后上样的效果无明显差别。这样，即减少设备同时缩短工期3倍以上。

3.酶的分离纯化一般需要在低温（10℃左右）室中进行，本法则在10-20℃即可，无需特别的低温致冷设备，相对降低成本。

4.所得止血灵成品，1-1.5酶活单位/kg体重剂量便能使家免全血凝血时间缩短1/3-1/2;1-2酶活单位能使正常人的全血凝血时间缩短1/3-1/2;1酶活单位注射于大白鼠皮下不出现出血斑点，由此表明该法生产的产品低毒、高效，质量可靠。

5.本发明的联产工艺，由于能同时得到两个药物，其经济效益相当高，经计算，投入产出比为8。