[发明专利]用于核酸定型的方法和试剂

说明书

本发明提供用于定型HLA    I型核酸DNA的方法和试剂。尤其是本发明涉及确定样品中核酸的HLA    I型DNA类型的方法，该方法包括：

（a）扩增样品中含HLA    I型等位基因第二或第三外显子序列的任何核酸;

（b）在所述探针仅正好与互补序列杂交的条件下，把步骤（a）中扩增的所述核酸与一组寡核苷酸探针杂交，且

（c）从步骤（b）中探针杂交的图形中确定来自所述样品的核酸含有的HLA    I型等位基因。另一方面，本发明涉及一种完成上述方法的药盒。

本发明能使人们定型各种来源的纯合或杂合样品，包括含RNA或cDNA模板的样品，并检测由目前的血清学，细胞学或生物化学方法不能区别的等位基因变异体。本发明的定型系统便于确定移植组织的类型，确定个体特征，以及鉴别对疾病敏感的个体。因此，本发明可用于医药和医学研究以及特殊的诊断领域，并可用于法医科学及分子生物学领域。

主要的组织相容性复合体（MHC）包括大量的编码与T细胞受体（TCR）一起的糖蛋白的基因，在T细胞对外源抗原的应答反应中，该糖蛋白是关键的特异性因素。有两种结构上有区别的但相关的MHC分子家族，它们给两种T细胞子系统提供抗原：I类MHC分子给表达CD8细胞表面糖蛋白的T细胞提供抗原，以及Ⅱ类MHC分子给表达CD4细胞表面糖蛋白的T细胞提供抗原。参见Bjorkman    and    Parham，1990，Ann.Rev.Biochem.59∶253-288。

HLA    Ⅱ型蛋白HLA    DR，HLA    DQ和HLA    DP是由人第6染色体短臂上的巨大的组织相容性复合体（MHC）区域中的基因编码。Ⅱ型蛋白质是由一个约34KDα链和约29KDβ链组成的杂二聚糖蛋白。Ⅱ型蛋白质在巨噬细胞，B-细胞，激活的T-细胞和其它类型细胞的细胞表面上表达，并涉及与辅助T-淋巴细胞粘附并给它提供抗原。参见由Giles和Capra，1985，Adv.Immunol.37∶1提供的题目为“Structure，function    and    genetics    of    Human    Class    Ⅱ    molecules”文章。另外，通过在成熟的T-淋巴细胞中，测定表达的T-细胞受体部分可知Ⅱ型蛋白质影响特异性免疫应答。有关HLA    Ⅱ型基因及蛋白质的一般论述，参见由Trowsdale    et    al.，1985Immunal.Rev.85：5提供的题目为“Structure，sequence    and    polymorphism    in    the    HLA    D    region”的文章。

人们已进行有大量试验以发展一种基于DNA的定型方法用于测定个体的HLA    Ⅱ型的表型。参见美国专利说明书No.4，582，788，该说明书描述了一个基于限制片段长度多形现象（RFLP）的试验。但是，这些以RFLP为基础的分析需要大量高分子量DNA，劳动量巨大，且有限数量的提供信息的限制酶本身又限制了获得的结果。

多聚酶链反应（PCR）的使用有利于对复合基因组DNA分析和操作。利用PCR方法能够扩增一个来自很复杂的核酸混和物的特定的核酸序列，且在美国专利说明书Nos    4，683，195;4，683，202;4，889，818和4，965，188和欧洲专利申请Nos    237，362和258，017中详细描述了该方法。PCR方法也有利于给个体的HLA    Ⅱ型DNA进行分类。通过设计的寡核苷酸引物，科学家们已经研究了基因组DNA中DRB座位的多形第二外显子并且使用这些引物扩增所需的序列。参见Scharf    et    al，1988，Hum.Immunol    22∶61的题目为“Sequence    analysis    of    the    HLA    DRB和HLA    DQB    loci    from    three    Pemphigus    vulgaris    patients”的文章。