[发明专利]地龙-碎栓酶制备方法

权利要求书

一种地龙-碎栓酶的制备方法，其特征在于：利用蚯蚓为原料，经前处理除毒，硫酸铵盐析，CM阳离子层析和DEAE阴离子层析和sephacry1-S200或TSK分子筛过滤方法生产出七种层析纯或电泳纯地龙--碎栓酶。其过程为：

a.将洗净蚯蚓放入0.31MNacl、0.31Mkcl或0.01M(NH₄)₂SO₄溶液中用20V电脉冲剌激使之排毒，及时更换溶液3至4次，直至无肉眼可见黄色分泌物排出为止。

b.将a所得除毒蚯蚓经细胞破碎后离心取上清部分；用硫酸铵分段盐析，样品为0.05MPBS溶剂的溶液含0.01%SDS、PH7.4，盐析温度4℃，盐析时间18小时；弃25%饱和度时的沉淀部分和65%饱和度时的上清部分，收集65%饱和度时的沉淀蛋白，脱盐后获得粗提取液。

c.将b所获得粗提取液用0.045M的醋酸盐缓冲液平衡式稀释；调样品PH为4.5，用0.045M醋酸缓冲液平衡CM柱，加样后在0--0.3MNacl范围内连续梯度洗脱，收集活性脱峰。

d.将c所获得活性洗脱峰，分别用PH7.4的PBS(0.05M)缓冲液平衡，调样品PH为7.4，上样后进行连续洗脱、洗脱条件为0.05MPBS，PH7.4，0--1MNacl，0.5mol/分脱洗速度。收集0.10-0.18M/1Nacl范围的活性峰洗脱液。

e.将d所得0.035M--0.08M范围内的活性峰洗脱液进行sephacry1--S200或TSK分子筛过滤，洗脱液为PH7.4PBS，流速为0.8Lmol/分。即可得到7种层析纯或电泳纯地龙--碎栓酶，分子量为1，5000、26900±300、27，000、27900±300、32000±300、33000、70，000道尔顿的蛋白酶。