[发明专利]地龙-碎栓酶制备方法

说明书

本发明涉及地龙-碎栓酶的制备方法。

地龙-碎栓酶是一种从蚯蚓组织中分离纯化的蛋白酶，它具有较高的纤维蛋白（元）降解作用和溶栓等药理作用，是当今最新的治疗栓塞症的药物。在目前治疗栓塞症临床常用的药物主要有SK（链激酶）、UK（尿激酶）、TPA（组织纤溶激酶）和蛇毒抗栓酶等，但以上药物都存在药源少，制备工艺复杂、价格昂贵、性质不稳定等缺点。目前虽然有生产地龙-碎栓酶的技术（发明人牛勃等），但现有的生产技术提取的地龙-碎栓酶，存在毒性不稳定，提取蛋白酶种类少（仅一种），且工艺复杂、成本高等不足，限制了生产规模的发展和临床应用。

本发明的目的在于：提供一种药源广泛、制备工艺简单、化学性质稳定、可获得七种蛋白酶，且经济的制备地龙-碎栓酶的方法。

本发明的目的是这样实现的：以新鲜蚯蚓为原料，经前处理除毒、细胞破碎、硫酸铵分段盐析、CM和DEAE纤维素柱析以及sephacryl-S200或TSK分子筛过滤方法生产出层析纯或电泳纯地龙-碎栓酶。

下面结合附图对本发明作详细介绍：

附图是本发明方法的工艺流程图。

本发明共7个主要步骤，即：除毒;细胞破碎;硫酸铵分段盐析;脱盐;CM层析;DEAE层析;sephacryl-S200或TSK分子筛过滤得到七种层析纯或电泳纯地龙-碎栓酶成分。

现分述如下：

a  除毒

在蚯蚓体内含有大量对人体有害及对随后工艺有干扰的毒素，因此，首先要将毒素除掉。具体方法是：

将适量新鲜蚯蚓洗净，用清水浸泡两日，使之吐尽肠胃道中的污物。再将蚯蚓放入0.1M Nacl、0.1MKcl或0.1M（NH₄）₂SO₄中，用20v电脉冲刺激使之排毒，及时更换盐溶液3至4次，直至无肉眼可见黄色毒液分泌为止。

b  细胞破碎

将上述步骤所获得的无毒蚯蚓用组织捣碎机或超声细胞破碎器进行匀浆，再用高速冷冻离心机离心（4℃，15，000rpm，15分钟），经过滤，除去沉淀，收集上清液。

c  硫酸铵盐析

将上述步骤上清液用硫酸铵分段法盐析。样品为0.05MPBS溶剂的溶液，含0.01%SDS、PH7.4，盐析温度4℃，盐析时间18小时;弃25%饱和度时的沉淀和65%饱和度时的上清部分，收集65%饱和度时沉淀蛋白，即有纤溶酶活性部分，离心速度为15，000rpm。

d  脱盐

将上述步骤所得有活性盐析部分用超滤法或透析法常规除盐，超滤或透析缓冲液为0.05M的PBS。获得粗提取液。

e  CM阳离子交换层析

将上述步骤所得粗提取液用0.045M的醋酸盐缓冲液平衡或稀释，使样品PH调至PH4.5。用0.045M醋酸缓冲液平衡CM柱。加样后在0-0.3MNacl范围内进行连续梯度洗脱，弃无活性洗脱峰，收集活性峰。

f  DEAE阳离子交换层析

将上述步骤所得活性部分，分别用PH7.4的PBS（0.05M）缓冲液平衡，调样品PH为7.4，上样后进行连续梯度洗脱。洗脱条件为：0.05PBS;PH7.4;0-1MNacl;0.5MOL/分洗脱速度。收集0.10-0.18M/LNacl范围的活性峰洗脱液。

g  sephacryl-S200或TSK分子筛过滤

将上述步骤所获得有纤溶酶活性样品进行sephacryl-S200或TSK分子筛过滤，（洗脱液为PH7.4PBS，流速为0.81，mol/分）即可得到7种层析纯或电泳纯DL-碎栓酶为15，000、26，900±300、27，000、27，900±300、32，000±300、33，000、70，000道尔顿的蛋白酶。

用本发明的方法，从蚯蚓体组织中提取DL-碎栓酶，生产工艺简单，产量高成本低，化学性质稳定，提取蛋白酶多（7种），纯度高。