[发明专利]蜡质芽孢杆菌转基因工程菌构建及生产方法

权利要求书

1、一种既能促进作物增产，又能杀灭鳞翅目害虫的工程菌，其特征在于：该菌是蜡质芽孢杆菌Bacillus Cereus，菌种编号：TB83-10，保藏号：CGMCC NO 0176。

2、一种转移Bt基因的方法，包括选择宿主菌株、基因分离、基因转移、重组质粒构建、基因分析、基因测试、工业化生产，其特征在于：转移Bt基因的方法如下：

a、选择作物增产菌为转基因工程的宿主菌株；

b、Bt基因及其相应载体构建重组质粒；

c、重组质粒转化大肠杆菌DH5a；

d、从大肠杆菌中提取重组质粒，并进行质粒纯化、电转化；

e、重组质粒转化进入作物增产菌中，从而获得转基因工程菌；

f、转基因工程菌经过基因分析、稳定性测试、昆虫毒理测试、田间杀虫试验，从而筛选出既有作物增产菌的遗传特性，又有Bt杀虫基因的作物增产菌工程菌菌株保藏号CGMCC NO 0176，保藏日期92年9月3日；

g、作物增产菌工程菌经过菌种活化、扩大培养、种子罐发酵、发酵罐培养，获得在农作物上应用的菌剂产品。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于Bt基因分离及其与相应载体构建重组质粒为：

a、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis var.Kurstaki HD-1)，其δ-内毒素基因原始克隆的大小为15，5kb，用Hind III酶消解，建立如下酶切反应体系：

DNA         3μI

酶切缓冲液   2μI 37℃下保温2小时

Hind III    1μI

重蒸馏水      13μI

总计          20μI

用低融点琼脂糖回收4.2kb片断，纯化；

b、载体大小为5.8Kb，具有一个多克隆位点和Amp及Kam抗性，用Hind III酶消解，用小牛肠道磷酸酯酶(CIP)脱磷酸化；

①首先从低融点胶上回收的载体DNA，用苯酚和氯仿抽提后乙醇沉淀；

②再将DNA溶于最小体积的10mM TrisHcl(pH8.0)，建立如下反应体系；

载体DNA          5μl

10×CIP缓冲液    5μl 37℃保温30分钟

CIP(1.4U/μl)    2μl

重蒸馏水         38μl

总计             50μl

③加入40μl重蒸水，10μl 10×SET，5μl 10％SDS，68℃保温20分钟；

④苯酚、苯酚/氯仿(24∶1)各抽提一次；

⑤加入1/10体积3M NaAc(pH7.0)、2倍体积冷无水乙醇-70℃下沉淀1小时，离心，70％乙醇沉淀，真空干燥后溶于重蒸水中。

c、连接时载体DNA和连接片断以1∶3的摩尔浓度混合，建立如下连接反应体系：

DNA(载体+片断)                13μl

10×连接缓冲液                2μl

5mM ATP                      2μl

100mMDTT                     2μl

T4DNA连接酶                  1μl(2.5U)

总计                         20μl12℃连接过夜连接后取2μl跑小胶，电泳后染色观察连接效果。