[发明专利]蜡质芽孢杆菌转基因工程菌构建及生产方法

说明书

本发明涉及向蜡质芽孢杆菌转移杀灭鳞翅目害虫的Bt基因工程菌及工业生产方法。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringsis)是Berliner从地中海粉螟罹病幼虫中分离出的一种芽孢杆菌，1915年命名为苏云金芽孢杆菌。1953年发现它的蛋白质伴孢晶体对鳞翅目幼虫有明显的毒效后，引起了人们广泛的重视。随后，1958年在国外首次出现了商品制剂，1959年发现此菌的一些品系产生热稳定毒素，对几个月昆虫的种类起杀伤作用，从而这种病原细菌很快地商品化。

苏云金芽孢杆菌主要是经口传染昆虫的，它可由菌体本身的活动而导致害虫的死亡，但导致害虫死亡的主要因素是菌体产生的毒素，毒素可使害虫在短时间内中毒死亡。苏云金芽孢杆菌在生产过程中所产生的毒素有几种，其中一类是内毒素，即伴孢晶体，其主要成份是蛋白质。在苏云金芽孢杆菌的孢子囊里，一端是芽孢，另一端是晶体，晶体一般呈菱形、圆形、正方形或不规则形。一个孢子囊一般只有一个晶体，偶然也有两个晶体是一种毒原，经昆虫胃液作用后析出有活性的毒素，受苏云金杆菌感染的鳞翅目幼虫，它们的胃液是碱性，其pH值与苏云金芽孢杆菌的生长繁殖pH相近，并且这个pH液与晶体的溶解程度有关。鳞翅目幼虫在食入毒素后几分钟可引起中肠麻痹，1～7小时肠壁破损，肠内碱性物漏入体腔，引起血液ph增高(增高1～1.5单位)，而导致全身瘫痪而死亡。也有的昆虫中肠麻痹后肠的内含物不漏入体腔，因而血液的pH值基本不变，无全身瘫痪症状，经2～4天死亡。苏云金芽孢杆菌各变种对50多种昆虫有不同程度的致病和毒杀作用。应用于防治农作物叶上那些取食量大、消化液呈碱性的害虫效果好。

由于化学农药对环境的污染引起了人们的不安，加上害虫抗药性的迅速形成，一般化学农药只能使用2～3年。随着生活水平的提高，人们更加关心食品卫生，而且苏云金芽孢杆菌制剂较其它微生物农药毒力高且速效，因此，Bt杀虫剂发展很迅速。例如日本的东亚合成化学公司对苏云金芽孢杆菌制剂已研究了三十五年，先后研制出了Bt死菌制剂和活菌制剂。又如美国的Mycogen专门微生物农药公司与日本的久保田公司合作，总投资20亿日元，开发Bt杀虫剂，现已推出了对斜纹夜蛾、茶小卷叶蛾高效的Bt死菌制剂。又如美国主要的玉米种子生产公司，Lowa州的Hi-Bred公司已放弃使用多年的化学杀虫剂，转向用生物防治剂苏云金芽孢杆菌来防治玉米螟。

与化学农药相比，苏云金芽孢杆菌使用安全，可较长时间保持其活性，害虫抗药性产生慢，但Bt制剂也存在一些缺点，那就是此菌对害虫的作用时间较长，使用效果受低温和阳光的影响，特别是日光的照射，对病原菌的存活有很大影响，在强烈阳光下，苏云金芽孢杆菌容易失活，晶体也发生破坏，对一些钻蛀性的害虫如玉米螟、稻螟蛉等，由于苏云金芽孢杆菌不是植物体内共生菌，只附着于植物体表，因而感染机会不多，防效不稳定。随着生物技术的发展，近年来杀虫微生物的研究国际上进展很快。苏云金芽孢杆菌所产生的毒素蛋白由毒素蛋白基因控制，1977年前苏联首次报道苏云金芽孢杆菌的毒蛋白由大质粒编码，1981年Schnepf等首次克隆了Bt毒蛋白基因：1989年美国的Calogero，S等人已经实现了苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuring-iensis subsp.kurstaki HD-73)δ-内毒素基因整合到Bacillus subtilis的染色体上并得到表达。1991年，Bar，-E等人，将苏云金芽孢杆菌以色列亚种的δ-内毒素基因克隆于B.sphaericus中并得到表达。

1989年，美国的Crissman，J.W.等人，将来自于Bacillus thuringiensissubsp kurstaki编码对Lepidoptera专化的δ-内毒素基因转移到Bacillussubtilis中得到表达，在细菌生长的对数生长后期时，其毒蛋白含量占全蛋白含量的25％。另外，美国的CGI公司，将Bacillus thuringensis的δ-内毒素基因转入一种Clavibacter xyli subsp.Cynodontis的细菌，构建了重组细菌，进行玉米株的接种，可以阻止European Corn borer的鳞翅目昆虫的幼虫对玉米根的危害。英国剑桥大学和美国华盛顿大学的二个研究小组发现大多数Bt毒蛋白有两个不同的功能区，一个是决定毒素攻击的昆虫种类的结合区，另一个区具有杀昆虫幼虫活性。Bt各菌株间结合区的氨基酸顺序相差很大，而所有毒素的杀幼虫区的氨基酸顺序几乎完全相同。据此，美国加州大学利用重组DNA技术将两种不同的Bt蛋白融和在一起。