[发明专利]从人体胎盘中提取核酸的方法

说明书

本发明涉及一种微生物。

目前国外有文献报导从植物或动物胎盘中提取核酸，即主要成分为脱氧核糖核酸DNA，其提取方法一般是参照Bellard法(Bellard MG et al.Isolationof highmolecular weight DNA form mammalian cells。Eur J Biochem 1973；36∶32)组织均浆离心后分离出的细胞核经裂解后用酚、氯仿、异戊醇除蛋白、钝化、乙醇沉淀最后制得的。其不足之处是该方法制得的核酸制品不纯，而且操作复杂，需消耗大量的有机溶剂。

鉴于上述现有技术中的不足之处本发明的目的在于提供一种能节省原材料简便地制备高纯度核酸的方法。

本发明的目的可通过以下措施来实现：

一种从人体胎盘中提取核酸的方法，其特征在于：a、原料及其处理：取人的新鲜胎盘在-10℃～70℃迅速冷冻，并在-4℃～-10℃去除脐带、胎膜及结缔组织，b、破碎胎盘组织：在-4℃～-10℃加入有如下摩尔体积比的提取液A即Tris-HCl∶EDTA∶NaCl＝5∶1∶1(mol/L)，其加入量是胎盘体积的5～10倍，然后置于高速匀浆器中匀浆，过滤，向滤液中加入10％的且为滤液体积1/100的SDS，并用10％～20％的NaOH将混合物的PH值调至8～10，在室温下搅拌1～2小时，c、提取核酸：向上述裂解液中加入等体积的新蒸酚与提取液A的体积比为70～75∶30～25的饱和酚，混合均匀后在2～4℃下离心20～40分钟，取上清液再向其内加入等体积饱和酚多次反复操作。d、提取核酸的处理：将提取的上清液置于备有电磁搅拌的透析袋内，于4℃下用流动蒸馏水作为透析外液，经过3～4天后更换成有如下摩尔体积比的Tris-HCl∶EDTA∶Nacl＝1∶1∶1的静止透析外液E，透析2～3天即可得到脱氧核糖核酸。采用上述人胎盘核酸可制备人胎盘核酸口服营养液，其组成如下：

人胎盘核酸              10～50％(V/V)

蔗糖                    5～8克/100毫升

香料                    0.1～0.5毫升/100毫升

余下量为水。

采用上述人胎盘核酸可制备人胎盘核酸化妆品，其组成如下：

人胎盘核酸              5～30％(V/V)

余下量为载体

透析袋为玻璃纸。

本发明的方法主要包括如下过程：

1.原料及其处理：本发明的原料为健康人的新鲜胎盘，取出后在-10℃～-70℃迅速冷冻，并在-4℃～-10℃去除脐带、胎膜及结缔组织以防止其酶解变性保持核酸稳定，使最终的核酸制品纯度较高。

2.破碎胎盘组织：在-4℃～-10℃条件下加入提取液A，该提取液是由Tris-HCl(PH5～8)、EDTA和NaCl组成的混合物，它们之间有如下比例关系，即Tris-HCl∶EDTA∶Nacl＝5∶1∶1(mol/L)。而该提取液A的加入量与胎盘之间有如下比例关系，即胎盘∶提取液A＝1∶5～10(体积比)。将胎盘与提取液A置于高速匀浆器中匀浆，所得产物经过滤除去胎盘中的结缔组织及纤维等残渣为下面的提取提供方便条件。向滤液中加入10％的SDS，其加入量与滤液的比例关系为滤液∶SDS＝100∶1(体积比)。用10％～20％的NaOH调整混合物的PH值使之PH在8～10之间，最好是PH在8.5～9之间以使细胞膜完全破裂。然后在室温下搅拌1～2小时，得到的即为组织裂解液。

3.提取核酸：向上述组织裂解液中加入等体积饱和酚，其是由新蒸酚和提取液A组成的，它们之间的比例关系为：新蒸酚∶提取液A＝70～75∶30～25(V/V)。在室温下将它们混合均匀，然后在2℃～4℃下离心20～40分钟，取上清液向其内再加入等体积饱和酚，混匀后再次离心反复操作至界面无蛋白为止。

4.提取核酸的处理：将提取的上清液置于透析袋中，该透析袋最好为玻璃纸袋，其内备有电磁搅拌，于4℃下采用流动蒸馏水作为透析外液。经过3～4天透析后将透析外液换成静止溶液E，其是由Tris-HCl(PH5～8)、EDTA和NaCl组成的混合物，它们之间的比例关系为：Tris-HCl∶EDTA∶NaCl＝1∶1∶1(mol/L)。仍在4℃下透析2～3天，每日更换透析液两次。用紫外分光度法测定透析外液有机溶剂的含量，当在270nm时光密度为0.05～0.10即为透析终点，所得到的透析袋内的液体主要为脱氧核糖核酸DNA，还有少量的核糖核酸RNA。