[发明专利]酶法合成胆红素

说明书

酶法合成胆红素属于以动物血液为材料使用酶法合成胆红素。

胆红素为100多种中成药制剂的主要成份，如人工牛黄、感冒清、扑热息痛片、银翘解毒丸等，因此市场需求量大。现国内外所用的胆红素都是从动物胆汁中提取的，但胆汁中天然胆红素含量相当低，猪胆汁为万分之四左右，牛胆汁中仅有万分之二。又由于胆汁原料缺乏，利用不充分，使胆红素市场价格昂贵。

近年来，国际上的胆红素的合成方面主要是化学合成法，如Bonne和McDonagn发表的用25mg氯化血红素进行偶合氧化的方法，得到四种胆绿素异构体，其比例接近1∶1∶1∶1，然后用硼氢化钠还原碱解制备出胆红素的四种异构体。这种化学合成法，操作繁杂，所用化学试剂昂贵，合成的四种异构体又不易分离，而适合药用的只是胆红素1Xα，其余三种1Xβ、1Xγ、1Xδ不仅无药理作用，而且对人体健康不利。1992年由Gosauer和Plieninger利用现代化技术的胆红素全合成方法，采用吡咯化合物为原料，通过亚甲基桥连接成胆绿素再还原成胆红素，这种方法要求的条件苛刻，成本昂贵。

国内对胆红素的研究主要是从胆汁中提取胆红素的工艺和方法的改进。如胆红素钙盐间接提取法，该方法落后，生产周期长，但收率稳定在万分之三左右，适合大规模生产，离子交换树脂法适合于小规模生产，树脂吸附不完全，收率低仅万分之一点六左右，较好的方法是色层快速提取法，生产周期短，一般4小时左右，操作简便，收率达万分之三至四。国内也有学者在从事化学合成胆红素的研究，利用血红素为原料，化学合成得到胆红素的四种异构体，但分离方法尚未很好解决，且成本高。

本发明旨在以动物血液为原料，用酶法一步合成无异构体的胆红素产品，解决国内外在胆红素合成上尚未解决的上述问题。

实现本发明的技术方案是，以动物血液为原料一步合成胆红素的工艺如下：

（1）在新鲜动物血中加入8%柠檬酸钠抗凝剂，在温度为5～10℃，速率3000r.p.m条件下离心15’，得到的血红蛋白液以10000r.p.m高速捣碎5’，破碎细胞成血红蛋白浆;

（2）在血红蛋白浆中，按新鲜血量的5%加入重组血红素加氧酶系的混合酶液和3倍血红蛋白浆量、pH为7.4的磷酸缓冲液上反应柱，同时在反应柱中加入2%的H₂O₂和5%葡萄糖液，在37℃温度条件下反应5小时;

（3）在经酶解的反应液中加入1N的氢氧化钠溶液，调节pH至11，并煮沸3’;

（4）碱解液在5℃温度条件下，以3000r.p.m速率离心15’去除蛋白;

（5）在上清液中按1∶1的重量比加入氯仿液，再调pH至4.5～5.0，分层，收集氯仿混合液;

（6）氯仿混合液经旋转蒸发浓缩后减压，在50℃温度下回收氯仿得胆红素液;

（7）胆红素液用无水乙醇、乙醚洗涤除去杂质得到胆红素，再在60℃温度中真空干燥为胆红素成品。

重组血红素加氧酶系混合酶液是从新鲜动物肝、脾制得的血红素加氧酶、胆绿素还原酶和NAOPH-细胞色素C还原酶以1∶1∶1的比例混合，加入pH7.4的磷酸缓冲液配制成50mM的酶液，并加入5%的肝糜浆即成。

下面进一步详述本发明。

关于血红素的卟啉环氧化断裂的机制虽然尚未完全了解，但已经知道，在生物体内网状内皮系统（主要是脾和肝脏中的星形细胞）内含有活泼的血红素加氧酶，它在氧分子（O₂）和NAOpH存在下，可将铁卟啉环上α-甲炔基（-CH＝）氧化断裂，释放出CO和Fe⁺²，并使两侧的吡咯环羟化，形成胆绿素，后者又在胆绿素还原酶的作用下，从NAOPH接受两个质子（H⁺）和两个电子（e^-）而还原成胆红素（见下列代谢途经）。

血红素加氧酶系引起血红降解的产物是专一性的胆绿素1Xα，因血红素加氧酶同血红素的结合是通过血红素-Fe并列结合到酶的组氨酸残基上，结果使卟啉环α-甲炔基桥断裂形成特异性的胆绿素1Xα，这种胆色素又被胆绿素还原酶催化还原成胆红素1Xα。