[发明专利]重组突变出血败血性巴斯德氏菌蛋白及其制备方法

说明书

本发明提供由得自某些出血败血性巴斯德氏菌（Pasteurella  multocida）基团的DNA顺序编码的新免疫原性蛋白，所述基因编码动物的进行性萎缩性鼻炎（PAR）发病过程中所涉及到的一些毒素。要求保护的蛋白毒性低、稳定性好、易于纯化，因此可用在疫苗中预防动物体由出血败血性巴斯德氏菌毒素（PMT）引起的各种病理作用。

PAR是动物尤其是猪的一种广泛传播的、具有高度传染性的感染性疾病，其中感染是由于鼻骨吸收作用而发生于口鼻部的正常骨结构的，造成口鼻部变形、打喷嚏、流鼻涕和鼻粘膜出血。在养猪业中，这种疾病由于造成生长延迟和对其他感染性疾病的易感性增加而造成巨大经济损失。

PAR的发病与动物的鼻腔内存在不同菌株的革兰氏阴性菌即出血败血性巴斯德氏菌有关，这种细菌产生一种具有溶骨活性的毒性蛋白，这种蛋白含有1285个氨基酸残基，其计算分子量约为146.5kD。

天然出血败血性巴斯德氏菌毒素（PMT）除具有溶骨活性外，还具有其他毒性作用，包括皮肤坏死作用、细胞致病作用及对细胞的促有丝分裂作用（增殖作用）。根据常规的急性毒性测试，例如测量杀死50%实验室小动物所需的剂量（LD₅₀），得知PMT毒性很高，在小鼠体内的LD₅₀值据报道在10-70ng的范围。

出血败血性巴斯德氏菌毒素具有免疫原性，因此，将该蛋白给予动物会诱发抗体形成，这可以保护动物免受这种毒素生产菌的病理作用。然而，天然毒素由于毒性高而不能作为一种疫苗组分使用。因此，用于对包括猪在内的动物进行抗出血败血性巴斯氏菌感染作用免疫接种的已知疫苗，含有已杀死的出血败血性巴斯德氏菌毒素生产细胞和/或产毒素出血败血性巴斯德氏菌的失活的（去毒的）含毒素提取物作为活性组分。这类失活的疫苗可在市场上买到。这类疫苗中PMT的失活一般是通过热处理或用醛（包括戊二醛和甲醛）处理而实现的，这两种处理都使毒素蛋白变性。

然而，已知对免疫原性蛋白进行热去毒或醛去毒可能会造成免疫原性降低或改变，这是一种不良的副作用，在很大程度上可能是由于蛋白质结构发生了不可预测的修饰作用，包括一个或若干个抗原决定基的构象修饰。值得注意的是，PMT的这类结构修饰作用会使具有其他特异性的抗体的产生受到优先刺激，并有可能造成对蛋白水解降解作用的敏感程度增加。此外，PMT的醛去毒过程造成一般约为1%的残留毒性。

因此，曾试图得到以去毒PMT为主要成分但却未经上述传统去毒处理的疫苗。WO89/09617公开了用重组方法去毒但仍具有免疫原性的PMT衍生物。这些PMT衍生物的大致制备方法是：分离PMT编码基团，通过用限制酶处理DNA而缺失该基因的一个较大片段，将如此截短的基因插入合适的宿主细胞中，并使该基因表达出截短形式的天然PMT。已产生了分子量在53-136kD范围的一些PMT衍生物，这些衍生物的毒性降低，同时又保留了大部分免疫原性。一般来说，这种截短蛋白所含有的氨基酸残基比天然PMT少50-500个。该文献中所公开的一个优选的PMT衍生物是衍生物O。

疫苗中合适免疫原性组分的一个重要特征是对一级、二级和/或三级结构的降解稳定。免疫原的降解可能是由化学和/或酶促水解作用产生的，也可能是由疫苗制备或贮存过程中存在的物理或化学因子产生的，这种降解会影响一级、二级和/或三级结构，使该组分的免疫原性降低，或迅速改变或逐渐改变。

上述降解作用除了对打算用作疫苗的蛋白的免疫原性有不利影响外，在工业上可能也是不希望有的，因为如果疫苗组合物中所含的免疫原已发生过降解，则该组合物中所含的蛋白分子缺少均一性。这种分子均一性的缺乏使人们很难得到标准化的疫苗组合物。

低成本出血败血性巴斯德氏菌疫苗生产中的另一个主要要求是，免疫原性组分要易于从产生该组分的细胞培养物中纯化。特别理想的是，该组分能够用简单的一步纯化法，如常规的阴离子交换色谱步骤，以基本纯净的形式分离出来。

现已发现，通过对PMT编码DNA顺序，如toxA基因，包括编码出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素的toxA基因，进行定位（位点特异性）诱变，能够得到具有高度免疫原性的低毒性PMT毒素相关蛋白，这些蛋白与用重组法去毒的已知PMT衍生物相比，更能耐受降解作用，更易于以工业规模纯化。