[发明专利]一种临床检验小儿骨碱性磷酸酶体外诊断试剂盒

说明书

本发明涉及一种临床检验小儿佝偻病体外诊断试剂盒。

小儿佝偻病是我国重点防治的小儿四大疾病之一。以往诊断此病常用X线摄像和血液生化检查。早期病人用X线摄像检查不易被发现;采用血液生化检查，不仅其可靠性较差，而且需从静脉取血，不易被家长和患儿接受。在一些条件较差的医院只能凭藉临床医生的经验诊断，容易造成误诊和漏诊。八十年代初，Rosalki等建立了凝集素亲和电泳，亲和沉淀检测骨碱性磷酸酶的方法，从而改善了其特异性。但因价格昂贵，不利于临床上推广普及。本发明旨在为临床诊断小儿佝偻病提供一种简便、快速、特异和敏感的试剂药盒。

本发明的设计是由全血干化学免疫浓缩反应装置（试条），样品稀释液，显色剂A液，显色剂B液以及一次性定量取样管，标准比色板，使用说明书组成。

一.全血干化学免疫浓缩反应装置（试条）是由血浆分离转运膜，样品处理垫，反应膜，吸附垫，保护膜，塑料基托和平衡垫组成。

图1全血干化学免疫浓缩反应装置（试条）平面俯视图

图2试条A-A′面的剖面图

图3附图2的部分放大图

图4试条中血浆分离转运膜的俯视图

图中1加样孔  2样品处理垫  3反应膜  4吸附垫  5血浆分离转运膜  6保护膜  7塑料基托  8平衡垫

图5全血干化学免疫浓缩反应装置（试条）制备工艺图

试条的基本构成材料及试条制备工艺如下（见图5）

反应膜将硝酸纤维膜（NC）经平衡处理后，印渍上含有5-7mg/mlUA-Ⅰ（圆豆凝集素同工凝集素Ⅱ）的印渍液，在4℃干燥，再经4-5%牛血清白蛋白第五部分（BSA.V）的100mmol  MES缓冲液封闭4小时，PH值6.0-6.5，在18℃条件下封闭4小时，再用洗涤剂含0.9%的NaCl100mmol MES缓冲液洗涤，PH值6.0-6.5，然后在保护液中浸泡，在4℃下干燥，即成为反应膜（图3-3）。

塑料基托  由PCV硬片制成，并在其上打孔10个（图3-8）。

平衡垫  由PCV软片，单面不干胶，双面不干胶制成，并在其上打孔100个（图3-9）。

样品处理垫将K49-2滤膜浸透样品处理液，在4℃下干燥，用冲裁模具压模制成圆片（图3-2）。样品处理液的组成成分为50-100mmolMES缓冲液，1-5mmol的Mg²⁺，PH值6.0-6.5。

吸附垫膜材料AP20，AP15滤膜，经专用冲裁模具加工成圆片，即成为吸附垫（图3-4）。

血浆分离转运膜  由膜材料K6902号滤膜制成。设计的形状和规格可实现血浆快速分离并定向转移至处理垫（图3.4中5，6）。

保护膜锡泊包装纸，用冲裁模具打一排10个孔（图3-7）。

将上述试条的各部分按图5的顺序用市售压膜双面不干胶粘贴为一体并切割成形。

二.样品稀释液的组成：10mmol MES缓冲液，Mg²⁺1-5mmol，PH值6.0-6.5。

三.显色剂A液。显色剂B液：A液含二乙醇胺（DEA）800mmol，Mg²⁺5mmol，溴氯吲哚磷酸盐（BCIP）1.0mmol。pH10.1，B液含二乙醇胺（DEA）800mmol，Mg²⁺5mmol，硝基氯化四氮唑兰（NBT）1.0mmol，临用前将A液，B液等量混合。

其操作步骤是：将30μl的全血滴加在试条的加样孔中，从图1至图4可以看出，血浆和血球在分离转动膜上分离，血浆定向转运至样品处理垫上，与预先固定在垫内的处理剂发生反应，达到反应所需的条件并与反应膜接触，通过吸附垫的毛细作用，使样品分次通过反应膜。样品中的骨碱性磷酸酶和固相在反应膜上凝集素UA-Ⅰ在流动过程中发生反应。洗去其他血浆成份，加入药盒中的显色剂显色，再与标准比色板对比，半定量读出血中骨碱性磷酸酶催化浓度。正常小儿的血浆无呈色反应，佝偻病患儿依其患病程度呈不同程度的紫色反应。

本发明的优点和积极效果是：简便-用30μl全血做样品，不必分离血清，不用其他特殊仪器，快速-取血后在10分钟内即可查出小儿是否患有佝偻病，特异-肝，胆碱性磷酸酶的交叉反应小于5%。稳定-试条及配套试剂在4℃下保存期一年以上。微量-只用30μl全血，克服了婴幼儿取血不易的困难。用本发明药盒对小儿佝偻病诊断的准确率为86.9%，高于用碱性磷酸酶总活性，25羟维生素D₃（75.0%），血钙（48.4%），血磷（46.9%）等方法测试该病的准确度;用本发明药盒对早期患病人的检出率达到50.3%，低于25羟维生素D₃（53.1%），但高于用碱性磷酸酶总活性（42.7%）。X线摄像（25.1%）。血磷（9.1%）。血钙（6.9%）的检出率，是目前诊断小儿佝偻病最简便可靠的血液生化指标。