[发明专利]人促巨核细胞生成素及其分离纯化和基因克隆方法及应用

权利要求书

1、一种新的人造血细胞生长刺激蛋白质因子，对巨核细胞的生长有明显的促进作用，按其特征取名为人促巨核细胞生长素(Megakaryopoietin简称MPO)，具有与表Ⅰ所列氨基酸序列相同或大部相同的蛋白质或具有生物活性的该蛋白多肽片段。

2、根据权利要求1所述的MPO，其特征是cDNA序列编码

a.与表Ⅱ所示cDNA序列相同或基本相同的cDNA序列

b.表Ⅱ所列cDNA序列的一个片段

c.能与之任一部分杂交的DNA序列

3、根据权利要求1所述的MPO，其特征是：

a.存在于再生障碍性贫血病人血清和尿中

b.能在60-90%乙醇饱和沉淀

c.能结合到麦胚凝集素Sepharose上

d.能结合到反向HPLC（C₄和C₁₈）上，并能在20-50%的化甲烷乙腈（Acetonitrite）液洗脱

e.在Superose 6凝胶层析柱中以PBS作为缓冲液从分子量25-55KD和7-13KD的组分中分离

f.能结合到肝素Sepharose柱上

g，在10%聚丙酰胺电泳，并经二巯基乙醇处理和小鼠骨髓细胞血浆凝块培养生物活性分析，其分子量为26-38KD或7-13KD

以上组成了基本的分离纯化方法。

4、根据权利要求1所述的MPO，其特征是具有刺激巨核细胞祖细胞的增殖，形成集落，并促进巨核细胞的分化成熟，与白细胞介素3（IL3），干细胞因子（Stem cell faclor），粒单细胞集落形成刺激因子（GM-CSF）或与促红细胞生成素（EPO）合用，能分别促进粒系或红系祖细胞的生长。

5、根据权利要求1和2所述的MPO，其特征是用基因工程方法从人胚肝cDNA文库中克隆筛查获得编码MPO的cDNA序列，并将其转化人哺乳类细胞，昆虫细胞，原生类细胞或细菌，通过表达从细胞培养悬液中分离纯化出MPO或其具有生物活性的蛋白多肽片段。

6、根据权利要求1所述的MPO或其活性片段制成的药物，包括单一成份或多种成份，糖化或非糖化的药物制剂。

7、根据权利要求1所述的MPO或其活性片段制成的药物，可以与治疗有效量的其他造血细胞生长因子和白细胞介素（Interleukin）1，3和11，粒细胞、粒单细胞和单核细胞集落形成刺激因子（G-CSF，GM-CSF和M-CSF），促红细胞生成素（Erythropoietin），干细胞因子（SCF）以及成纤维细胞生长因子（FGF）配伍制成。

8、根据权利要求6和7所述的药物制剂，可以治疗各种血小板减少症，血细胞减少症。

9、根据权利要求1所述的MPO或其活性片段可用作研究造血细胞生长调节和它们的受体的试剂。

10、根据权利要求1所述的MPO或其活性片段或类似物可用作体外或EX  VIVO造血干细胞和巨核细胞祖细胞扩增的重要试剂。

表Ⅰ.人MPO的氨基酸序列

5  10  15  20  25

1 M A W K T L P I Y L L L L L S V F V I Q Q V S S Q

26 D L S S C A G R C G E G Y S R D A T C N C D Y N C

51 Q H Y M E C C P D F K R V C T A E L S C K G R C F

75 E S F E R G R E C D C D A Q C K K Y D K C C P D Y

101 E S F C A E V H N P T S P P S S K K A P P P S G A

126 S Q T I K S T T K R S P K P P N K K K T K K V I E

151 S E E I T E V K D N K K N R T K K K P T P K P P V

176 V D E A G S G L D N G D F K V T T P D T S T T Q H

201 N K V S T S P K I T T A K P I N P R P S L P P N S

226 D T S K E T S L T V N K E T T V E T K E T T T T N

251 K Q T S T D G K E K T T S A K E T Q S I E K T S A

276 K D L A P T S K V L A K P T P K A E T T T K G P A

301 L T T P K E P T P T T P K E P A S T T P K E P T P

326 T T I K S A P T T P K E P A P T T T K S A P T T P

351 K E P A P T T T K E P A P T T P K E P A P T T T K

376 E P A P T T T K S H P P L P R S C X X X X C T Q P

401 T P K E P H P P L P R S L H P P T K E P A P T T P

426 K E P A P T A P K K P A P L P P L E X X X K K K K

451 K K

表Ⅱ.人MPO的cDNA序列

1  TTTCAGGTAC  CGTAGGTACC  CTTGCCGTAA  AGGATGGCAT

41  GGAAAACACT  TCCCATTTAC  CTGTTGTTGC  TGCTGTCTGT

81  TTTCGTGATT  CAGCAAGTTT  CATCTCAAGA  TTTATCAAGC

121  TGTGCAGGGA  GATGTGGGGA  AGGGTATTCT  AGAGATGCCA

161  CCTGCAACTG  TGATTATAAC  TGTCAACACT  ACATGGAGTG

201  CTGCCCTGAT  TTCAAGAGAG  TCTGCACTGC  GGAGCTTTCC

241  TGTAAAGGCC  GCTGCTTTGA  GTCCTTCGAG  AGAGGGAGGG

281  AGTGTGACTG  CGACGCCCAA  TGTAAGAAGT  ATGACAAGTG

321  CTGTCCCGAT  TATGAGAGTT  TCTGTGCAGA  AGTGCATAAT

361  CCCACATCAC  CACCATCTTC  AAAGAAAGCA  CCTCCACCTT

401  CAGGAGCATC  TCAAACCATC  AAATCAACAA  CCAAACGTTC

441  ACCCAAACCA  CCAAACAAGA  AGAAGACTAA  GAAAGTTATA

481  GAATCAGAGG  AAATAACAGA  AGTAAAAGAT  AACAAGAAGA

521  ACAGAACTAA  AAAGAAACCT  ACCCCCAAAC  CACCAGTTGT

561  AGATGAAGCT  GGAAGTGGAT  TGGACAATGG  TGACTTCAAG

601  GTCACAACTC  CTGACACGTC  TACCACCCAA  CACAATAAAG

641  TCAGCACATC  TCCCAAGATC  ACAACAGCAA  AACCAATAAA

681  TCCCAGACCC  AGTCTTCCAC  CTAATTCTGA  TACATCTAAA

721  GAGACGTCTT  TGACAGTGAA  TAAAGAGACA  ACAGTTGAAA

761  CTAAAGAAAC  TACTACAACA  AATAAACAGA  CTTCAACTGA

801  TGGAAAAGAG  AAGACTACTT  CCGCTAAAGA  GACACAAAGT

841  ATAGAGAAAA  CATCTGCTAA  AGATTTAGCA  CCCACATCTA

881  AAGTGCTGGC  TAAACCTACA  CCCAAAGCTG  AAACTACAAC

921  CAAAGGCCCT  GCTCTCACCA  CTCCCAAGGA  GCCCACGCCC

961  ACCACTCCCA  AGGAGCCTGC  ATCTACCACA  CCCAAAGAGC

1001  CCACACCTAC  CACCATCAAG  TCTGCACCCA  CCACCCCCAA

1041  GGAGCCTGCA  CCCACCACCA  CCAAGTCTGC  ACCCACCACT

1081  CCCAAGGAGC  CTGCACCCAC  CACCACCAAG  GAGCCTGCAC

1121  CCACCACTCC  CAAGGAGCCT  GCACCCACCA  CCACCAAGGA

1161  GCCTGCACCC  ACCACCACCA  AGTCTCACCC  ACCACTCCCA

1201  AGGAGCTGCA  C?????????  ?TGCACCCAA  CCAACTCCCA

1241  AGGAGCCTCA  CCCACCACTC  CCAAGGAGCC  TGCACCCACC

1281  AACCAAGGAG  CCTGCACCCA  CCACTCCCAA  AGAGCCTGCA

1321  CCCACTGCCC  CCAAGAAGCC  TGCCCCTCTA  CCCCCTCTAG

1361  AGCC??????  ?AAAAAAAAA  AAAAAAAAAA