[发明专利]人促巨核细胞生成素及其分离纯化和基因克隆方法及应用

说明书

本发明涉及人促巨核细胞生成素（Human megakaryopoietin简称MPO）的分离纯化，基因（cDNA）克隆，氨基酸和核苷酸顺序测定以及采用基因工程方法生产重组人MPO，以及MPO本身或含有MPO的制剂作为治疗血小板和其它血细胞减少症的药物或保健品，或作为研究和临床诊断试剂的应用。

已知造血细胞是能增殖和分化进一步产生成熟血细胞的前体细胞，有髓系造血细胞和淋巴系造血细胞之分，髓系造血细胞包括红细胞，白细胞和巨核细胞三个系列。红细胞主要负责机体组织中氧气，二氧化碳和一些营养物质或废物的交换。白细胞主要负责抵御感染的功能，巨核细胞则产生血小板，后者在机体止血和凝血中起关键作用。

已知造血细胞均来自一共同的多能干细胞，后者具有自我复制更新的能力并在一定的条件能进一步分化增殖为各系定向祖细胞。这些造血干细胞和祖细胞在体外培养体系中具有不同的增殖能力和细胞表型，据此可加以鉴别和分类。

已知造血是一个复杂的过程，受许多因子调节，包括各种细胞介素（Interleukin），集落形成刺激因子（GM-CSF，G-CSF，M-CSF）和其它细胞生长刺激因子，如干细胞因子（Stem cell  factor），促红细胞生成素（Erythropoietin，简称EPO）和成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，简称FGF）。对巨核细胞血小板生成有刺激作用的因子有IL1，IL3，IL6，IL11，GM-CSF，SCF和FGF（韩忠朝等，中华血液杂志，14：159-161，1993Caen&Han，C R Acad Sci Paris，316：925-30，1993）。这些因子均已采用基因重组技术生产，少数已用于临床试验或治疗，但提高巨核细胞和血小板数量的作用不明显。此外，这些因子的活性十分广泛，临床应用指征不明确且具有一定的副作用。

已知再生障碍性贫血或化疗诱发骨髓衰竭的病人其血清和尿中含有很高的能促进巨核细胞生长和分化，增加血小板生成的活性物质，许多研究者试图去鉴别，分离这种物质，并取得一些资料（Hoffman，Blood，74：1196-212 1989;Mazur等，Blood，76：290-7 1990;EricKson-Miller等，Br J Haematol，84：197-203，1993），但至今未能获取结构明确并具活性的天然或基因重组因子。

本发明的目的是：

（1）采用本发明的一套生化方法，从再生障碍性病人的尿和血清中分离纯化出一种新的蛋白质因子，即一种新的造血细胞生长因子-人促巨核细胞生长素。

（2）建立一套制备MPO的生化方法和MPO的cDNA克隆方法，并提出了采用重组DNA技术用基因工程方法大量生产MPO的技术方案。

（3）MPO应用的技术方案。

本发明建立了一套分离方法从再生障碍性贫血病人的尿和血清中分离纯化出一种新的具有调节巨核细胞生长，分化和成熟活性的蛋白因子，取名为促巨核细胞生长素（Megakaryopoietin，简称MPO）。根据蛋白质顺序，设计出相应的核苷酸引物在人胚肝cDNA文库中筛选出MPO的cDNA克隆，并测出其核苷酸顺序。

MPO的分离方法：

作为本发明的首要方面，我们建立了一套新的生化分离方法从再生障碍性贫血的尿以及血清中分离出一个新的蛋白质，这套方法如下：

1.取再生障碍性贫血病人的尿液，加0.1%酚（Phenol）后超滤浓缩（Amicon YM10过滤器），再经过Sephadex G50柱，收集含蛋白质部分或直接取再生障碍性贫血病人的血清。

2.加入氯化胍（3M）处理，再加乙醇沉淀（60-90%饱和）。

3.收集沉淀，用PBS缓冲液透析。

4.经透析的清液上麦胚凝集素（WGA）-Sepharose（Pharmacia  LKB）柱层析，用PBS作为缓冲液，2M乙酰葡糖胺洗脱。

5.洗脱液上反向HPLC-VYDAC  C18柱，用A液：0.1%三氟醋酸，B液：70%化甲烷乙腈-0.1%三氟醋酸，40分钟梯度洗脱。

6.Superose6-HPLC（Pharmacia  LKB）柱层析，PBS作为缓冲液。

7.肝素-Sepharose柱（Bio-Rad）层析，用A液：0.1%三氟醋酸，B液：70%化甲烷乙腈-0.1%三氟醋酸，30分钟梯度洗脱。

8.反向HPLC-Nucleosil C4柱，收集产物。

（方法流程见说明书附图1）。