[发明专利]一种制备重组链激酶的方法

权利要求书

1、一种重组链激酶的制备方法，包括链激酶基因克隆的构建，在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化，其物征在于：(1)从人口腔分离溶血性链球菌，培养液中提纯链激酶，测定其N末端和C末端氨基酸顺序作设计PCR引物的参考，用溶血性链球菌大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增链激酶基因，链激酶基因经核苷酸顺序分析证实后与含有PL、PR启动子、CIT857基因以及5SRNA终止信号的原核表达载体PLY-4质粒组装成高效表达质粒pSTE-SK-1；(2)pSTE-SK-1转化大肠杆菌K802(ATCC33526)，用温度诱导r-SK基因的表达，表达产物以包涵体形式存在于工程菌内；(3)通过发酵技术扩增工程菌，用温度诱导基因表达，发酵参数为温度28℃-42℃，氧溶量为50％-80％，pH6-8；(4)发酵后用高压破碎细菌，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，盐酸胍溶解，和r-SK的复性后，再用凝胶过滤、离子交换二步法纯化产品。(5)构建的链激酶因的核苷酸顺序如下：

ATG AAA AAT TAC TTA TCT TIT GGG ATG TTT GCA CTG CTG TTT GCA TTA ACA TTT GGA

Met Lys Asn Tyr Leu Ser Phe Gly Met Phe Ala Leu Leu Phe Ala Leu Thr Phe Gly

                                    10ACA GTC AAG CCT GTC CAA GCT ATT GCT GGG TCT GAG TGG CTG CTA GAC CGT CCA TCT GTCThr Val Lys Pro Val Gln Ala Ile Ala Gly Ser Glu Trp Leu Leu Asp Arg Pro Set Val20                                      30AAC AAC AGC CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT GTT GAG GGG ACG AAT CAA GAC ATTAsn Asn Set Gln Leu Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gln Asp Ile40                                      50AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATT CAC CTA ACA TCA CGA CCT CCT CAC GGA GGA AAG ACA GAGSet Leu Lys Phe Phe Glu Ile His Leu Thr Ser Arg Pro Ala His Gly Gly Lys Thr Glu60                                      70CAA GGC TTA AGT CCA AAA TCA AAA CTA TTT GCT ACT GAT AGT GGC GCG ATG CCA AAT AAAGln Gly Leu Set Pro Lys Set Lys Leu Phe Ala Thr Asp Set Gly Ala Met Pro Asn Lys80                                      90CTT GAA AAA GCT GAC TTA CTA AAG GCT ATT CAA GAA CAA TTG ATC GCT AAC GTC CAC AGTLeu Glu Lys Ala Asp Leu Leu Lys Ala Ile Gln Glu Gln Leu Ile Ala Gln Val His Set100                                     ll0AAC GAC GAC TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ACT GAT CGA AACAsn Asp Asp Tyr Phe Glu Val Ile Asp Phe Ala Set Asp Ala Thr Ile Thr Asp Arg Asn120                                     130GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT GGT TCG GTA ACC TTG CCG ACC CAA CCT GTC CAAGly Lys Val Tyr Phe Val Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro Thr Gln Pro Val Gln140                                     150GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AATGlu Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn160                                     170CAA GCG AAA TCT GTT GAT GTG GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CCC TTA AAC CCT GAT GACGln Ala Lys Set Val Asp Val Glu Tyr Thr Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn Pro Asp Asp180                                     190GAT TTC AGA CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAG CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC ACCAsp Phe Arg Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys Thr Leu Ala Ile Gly Asp Thr200                                     210ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC AAA ACC CAC CCA GGCIle Thr Set Gln Glu Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ser Ile Leu Ash Lys Thr His Pro Gly220                                     230TAT ACG ATT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC ACT CAT GAC AAT GAC ATT TTC CGT ACGTyr Thr Ile Tyr Glu Arg Asp Ser Ser Ile Val Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr240                                     250ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG TTT ACT TAC CAT GTC AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT GAAIle Leu Pro Met Asp Gln Glu Phe Thr Tyr His Val Lys Ash Atg Glu Gln Ala Tyr Glu260                                     270ATC AAT AAA AAA TCT GGT CTG AAT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GAC CTG ATC TCT GAG AAAIle Asn Lys Lys Ser Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Ash Thr Asp Leu Ile Set Glu Lys280                                     290TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC TTT GAT CGC AGT CAC TTG AAATyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Phe Asp Arg Set His Leu Lys300                                     3l0CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC AAC ACC AAC GAA TTG CTA AAA AGC GAG CAG CTCLeu Phe Thr Ile Lys Tyr Val Asp Val Asn Thr Asn Glu Leu Leu Lys Set Glu Gln Leu320                                     330TTA ACA GCT AGC GAA CGT AAC TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GCTLeu Thr Ala Ser Glu Arg Ash Leu Asp Phe Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg Asp Lys Ala340                                     350AAA CTA CTC TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA AAALys Leu Leu Tyr Asn Asn Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Lys360                                     370GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACC AAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT AGT GGC AAG CGA CCCVal Glu Asp Asn His Asp Asp Thr Asn Arg Ile Ile Thr Val Tyr Met Gly Lys Arg Pro380                                     390GAA GGA GAG AAT GCT AGC TAT CAT TTA GCC TAT GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAAGlu Gly Glu Asn Ala Set Tyr His Leu Ala Tyr Asp Lys Asp Arg Tyr Thr Glu Glu Glu400                                     410CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG CGT TAT ACA GGG ACA CCT ATA CCT GAG AAC CCT AAA GACArg Glu Val Tyr Ser Tyr Leu Arg Tyr Thr Gly Thr Pro Ile Pro Glu Asn Pro Lys Asp420                                     430AAA TAALys440