[发明专利]一种制备重组链激酶的方法

说明书

本发明属生物技术方法。

目前特效溶栓药物有人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)，链激酶(SK)，苯甲氧酰纤溶酶原激活剂链激酶复合物(APSAC)等。1993年9月美国Brigharm and Women′s医院，Ridker教授等总结了10万例急性心肌梗塞的溶栓治疗，其结果显示上述各类溶栓药物的药效和副反应无明显差别。rt-PA价格昂贵，每剂2300美元，SK价格比rt-PA低10倍，而且栓塞复发率低，使用较简便。

目前国外各公司用致病性溶血性链球菌作生产菌株，需要顾及环境及工人安全，去除引起低血压，发热等副反应的毒素，以及溶血栓链球菌SK产量低不易纯化等原因，使工艺及设备复杂，成本高，价格贵。80年代初Ferrtti J.J.等从溶血性链球菌噬菌体分离到SK基因，并在大肠杆菌中进行表达，但表达水平很低，只有数百单位/ml菌液，未形成基因工程产品。 1986年和1981年美国和日本的同一专利中SK基因分离与Ferrtti J.J.相同，但表达载体和培养条件不同，在大肠感菌中的表达水平为60～274ug/ml菌液，即6420～29300单位/ml菌液，无纯品得率等数据，也未见形成基因工程产品，1992年古巴HerrenaL.研制了重组链激酶，但其基因构建过程繁琐，在大肠杆菌中的表达水平低，纯化方法复杂，而且纤溶酶原亲和吸附剂等原材料价格昂贵，其产物纯度和得率低，成本高。

本发明的目的为克服现有技术中不安全、成本高的缺点，发明一种用生物高技术制备重组链激酶的方法，使制备过程安全、产品的得率和纯度都很高而成本低。

本发明采用下述技术方案：

(1)从人体口腔分离溶血性链球菌，从培养液中提纯链激酶，测定N末端和C末端5个氨基酸顺序作设计引物的参考。用溶血性链球菌大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增链激酶基因，链激酶基因经核苷酸顺序分析证实后与原核表达载体例如含PL，PR启动子，CIT857基因以及5SRNA终止信号等调控元件的PLY-4质粒组装成高效表达质粒pSTE-SK-l；

(2)pSTE-SK-1转化大肠杆菌，用温度诱导r-SK基因的表达，SDS-PAGE证实表达产物r-SK分子量为43000，以包涵体形成存在于工程菌内，占菌体蛋白的65％以上，工程菌命名PSTE-SK-1；

(3)通过发酵技术扩增工程菌，用M9CAA作基础培养液，温度诱导前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等补液料，发酵参数为温度30-42℃，氧溶量为50-80％，pH6-8，发酵后用高压破碎细菌，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，盐酸胍溶解，和r-SK的复性后，再用凝胶过滤，离子交换二步法纯化产品。

用本发明方法，每升发酵液得湿菌20克左右，r-SK产品纯度达97-99％，比活性10万IU/mg，纯品产量每升发酵液得600毫克。

纯品r-SK溶液中加入人血清白蛋白，谷氨酸钠以及磷酸盐等稳定剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成白粉状成品。注射用水溶解后应用，以治疗急性心肌梗塞等血栓性疾病为主要用途。

治疗实验性狗心肌梗塞，兔股动脉血栓症(0.3mg/kg)等均在30-60min后血栓溶解，血管再通。治疗兔眼内积血时(10-20u/眼)，24小时后积血消失。治疗兔眼内出血时，数小时后渗出物消失。

本发明运用重组DNA技术，在非致病性大肠杆菌中高效表达r-SK，方法安全，不给环境和操作人员带来任何危害，由于其高效表达和纯化方法简单，使产品的纯度和产量都很高，因此大大降低了r-SK的生产成本及其价格，下表是古巴Herrena L和本发明方法的对照。

      古巴Herrena L                  本发明  表达水平占大肠杆菌菌体蛋白25％         65％以上  纯化方法纤溶酶原-Sepharose亲和         离子交换，凝胶过滤

      层析，离子交换，凝胶过滤等  纯度    比活性5.2万IU/mg               10万IU/mg

      SDS-PAGE显示r-SK               98～99％

      占95％                         500～600mg/L发酵液  纯品得率r-SK 50mg/L发酵液

实施例(一)：    

1、用PCR扩增链激酶基因。