[发明专利]一种人肿瘤坏死因子α衍生物及其制备方法

权利要求书

1、一种人肿瘤坏死因子α衍生物a(hTNF  α  Da)的抗肿瘤药，是改变人肿瘤坏死因子α一级结构得到的一种药物，与人肿瘤坏死因子hTNF  α比较，hTNF  α  Da的特征在于：

(1)N端缺失7个氨基酸；

(2)C端第8、9、10位氨基酸由原来的Pro-Ser-Asp改为Arg-Lys-Arg；

(3)第157位氨基酸由原来的Leu改为Phe；

(4)hTNF  α  Da共150个氨基酸。

2、人肿瘤坏死因子α衍生物a的制备方法，包括从人基因文库中分离肿瘤坏死因子α基因、PCR引物设计、定点诱变表达载体的构建和表达、发酵及分离纯化，其特征在于：

（1）从人基因组文库中分离出hTNFα基因，切出第4外显子，接上人工合成寡聚核苷酸片断，组装成hTNFαcDNA，作PCR扩增TNFα衍生物acDNA的模板;

（2）PCR引物设计为：

5′GCC ATA TGC GCA AAC GTA AGC CTG TAG CCC ATG TTG TAG CAA ACC CTCA3′

5′CCG GAA TTC TCA GAA GGC AAT GAT CCC AAA GTA3′

（3）将构建成的hTNFαDa cDNA插入表达载体pJLA503在大肠杆菌中表达;

（4）hTNFαDa工程菌的发酵，产物的分离纯化。

3、根据权利要求1所述的hTNFαDa的制备方法，其特征在于工程菌发酵、分离纯化更佳条件：

（1）工程菌单菌落活化后接种TB培养液，25～30℃振荡培养2～3小时，30秒～1分钟内升温至40～42℃，继续培养3～4小时，然后4000～6000rpm离心，超声破菌;

（2）取上清液加固体硫酸铵40～60%（重量百分比），离心，留沉淀。