[发明专利]一种人肿瘤坏死因子α衍生物及其制备方法

说明书

本发明涉及人肿瘤坏死因子衍生物及其生物工程制备方法。人肿瘤坏死因子α是一种具有生物活性的细胞毒蛋白，它能直接引起某些体外培养的肿瘤细胞发生裂解并抑制增殖，使体内一些肿瘤发生出血性坏死。国外自1985年起已开始用生物工程技术获得的重组人肿瘤坏死因子α，rhTNFα治疗癌症病人，每名癌症病人治疗一个疗程一般需要毫克级的hTNFα。纯度95%以上，比活为2×10⁷单位/毫克蛋白质的rhTNFα售价为每10微克250美元，一个患者一个疗程需耗资几千或上万美元，代价十分昂贵。另外hTNFα是一种对酸敏感的可溶性蛋白质，它在血浆中的半衰期不到30分钟，在临床应用中发现在疗效有效的剂量范围内会引起毒副反应，从下表中可见hTNFα在治疗多种疾病时产生的利弊：

治疗效果  毒副作用

1、抗肿瘤免疫监测作用  1、介导内毒素休克

2、抗寄生虫和病毒  2、打乱代谢而导致恶形质

3、抗细菌  3、活化某些病毒（如HIV）

4、嗜中性细胞、巨噬细胞和  4、关节炎炎症

内皮细胞中激活炎症活性  5、与器官移植引起的疾病有关

5、预防自体免疫糖尿病  6、软骨中蛋白糖苷的再吸收

由此看来，减低毒性，提高有效活性，制备一种高效低毒的hTNFα是人们寻求的目标。

本发明的目的是用一种成本不高的基因工程方法制备hTNFαDa，一种高效低毒的hTNFαDa。

人肿瘤坏死因子α衍生物有多种，本发明的一种命名为a（hTNFαDa，humantumor necrosis factor α derivative a），它是以人肿瘤坏死因子α为原型，根据分子设计和剪裁改建成的一种新型蛋白质分子。本发明的hTNFαDa的结构与人肿瘤坏死因子α即hTNFα比较，有如下的特点：N端缺失7个氨基酸;C端第8、9、10位氨基酸由原来hTNFα的Pro-Ser-Asp改为Arg-Lys-Arg;第157位氨基酸由原来Leu改为Phe。这种基因工程产物，是自然界原先不存在的，可作为抗肿瘤药物。

hTNFα活性状态是三聚体，单体由157个氨基酸组成，分子量是17，356道尔顿。hTNFα的N端处于游离状态，N端即使减少8个氨基酸，也不会丧失生物学活性。但抗N端15个氨基酸的抗体能中和hTNFα的活性。C端与三聚体的形成有关，hTNFα完整的C端序列对保持其活性是不可少的，与细胞毒活性直接有关的是第29～35位氨基酸，第84～91位氨基酸和第143～148位氨基酸。本发明考虑到hTNFα作为药物引起的毒副反应，改造了hTNFα分子结构，以TNFα为原型构建了hTNFαDa分子结构，经生物学性质测定，说明hTNFαDa是符合预期目标的衍生物。

hTNFαDa N端12个氨基酸序列经测定，Net，Arg，Lys，Arg，Lys，Pro，Val，His，Val，Val，Ala完全符合原设计的结构。

hTNFαDa的编码序列经测定，也完全符合原设计的DNA序列。

hTNFα与hTNFαDa编码序列比较如下：

hTNF α  5' CAT ATG GTT GGT TCT TCT TCT CGT ACC CCG AGT GAC

Pro Ser Asp

hTNF α Da  5' CAT ATG  CGC AAA CGT

deletion  Arg Lys Arg

hTNF α  AAG CCG GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CA

hTNF α Da  AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CA

hTNF α  TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG TGA GGA GGA CGA

leu

hTNF α Da  TAC TTT GGG ATC ATT GCC TTC TGA 3'

phe

hTNF α Da TAC TTT GGG ATC ATT GCC TTC TGA 3'

phe

hTNF α  ACA TCC AAC CTT  3'