[发明专利]以稳定的形式使用和储运金属蛋白酶的方法

说明书

本发明涉及酶领域，尤其涉及在金属蛋白酶的使用和储运过程中使其稳定的方法，具体地讲，以含酶水溶液形式使用和储运这种酶的方法。本发明同时还涉及稳定化的酶组合物。

蛋白酶可用于种类食品工业和洗涤剂领域。在以水溶液或淤浆形式使用蛋白酶的场合，已知的是，由于自发的自溶或变性作用(pH及温度等)，酶损失其活性。

最近，已开发出一种合成二肽甜味剂aspartame的方法，该方法利用由(中性)金属蛋白酶，例如“嗜热菌蛋白酶”(由Daiwa化学公司生产)(见诸于K.Oyama，Bioindustry，Vol 2，No.9，5-11页，1985)所催化的缩合反应。因此，蛋白酶，尤其是金属蛋白酶已经成为工业领域中重要的肽合成酶。但是，当以水溶液或淤浆形式被使用或存放长时间之后，这些酶不稳定。

(金属)蛋白酶通常以粉末状在商业市场上出售。由于当酶粉末粘附到喉或眼的粘膜上时，会引起相应部位的炎症，而粉状酶又易形成气溶胶，故而就引起了一个安全问题。另外也可能出现变应原效应。因此，近来从操作安全性考虑，(金属)蛋白酶均做成溶态产品或淤浆使用。然而由于酶自身的稳定性，此种液态酶或酶淤浆在使用和储运当中必须处于低温下操作，这通常导致成本较高(低温储存、活性较低等因素)。

况且，当金属蛋白酶用于N-苄氧羰基-L-天冬氨酸(以下称做“Z-Asp”)与L-或D L-苯基丙氨酸甲酯(以下称做“PM”)之间的偶合反应(这是生产α-L-天冬酰-L-苯基丙氨酸甲酯(以下称做“Aspastame”或者“APM”)的一种方法)时，活性酶浓度下降的现象，除酶的稳定性问题之外，还由于酶吸附于N-苄氧羰基天冬酰-苯基丙氨酸甲酯(以下称“Z-APM·PM”，例如“Z-APM·DPM”)加成产物晶体表面所造成。

在金属蛋白酶，例如由热蛋白分解素杆菌ROKKO生产出的“嗜热菌蛋白酶”，以溶液或其淤浆形式储存或使用的情况下，已知道，若无一定浓度钙离子存在，该种酶将迅速失活。然而当有钙离子存在时，由于生成碳酸钙，在导管和罐的各部位可能出现结垢，这往往在酶的实际使用中具有显著的有害影响。

本发明要达到的目的在于提供一种以稳定、不结垢形式使用和储运金属蛋白酶或类似蛋白酶的方法，同时还提供此类稳定的蛋白酶组合物。

本发明欲达到的进一步目标是提供一种提高回收率的方法，这是通过抑制酶在反应产物晶体(Z-APM·(D)PM)上被吸附来达到的。

按本发明，存在或添加一种N-保护氨基酸(以下称为“NPAA”)对于防止金属蛋白酶失活，尤其显著改进酶的热稳定性和储存稳定性颇为有效。特别值得指出，已发现N-苄氧羰基-氨基酸(以下称为“NZAA”)的效果是显著的。此外，根据本发明，借助NPAA的存在或添加，即使没有过量钙离子存在，金属蛋白酶也可以获得显著的稳定化。如此说来，本发明目的的达到在于，在含蛋白酶的水溶液或淤浆中存在或加入N-保护氨基酸。

另外，由于在淤浆存在下搅拌作用引起的金属蛋白酶的失活，借助NPAA的存在或加入也显著受到抑制，此乃另一个特点。

而且，根据本发明，当金属蛋白酶用于Z-Asp与PM之间的偶合反应时，NPAA的存在可使该酶显著稳定化，从而使回收率显著提高。

具体地说，本发明可以被有利地用于，在NPAA存在下储存或运送金属蛋白酶溶液或淤浆，或者在氨基酸酶催化偶合，特别在aspartame制备过程中利用这种效应。根据本发明，因少量NPAA的存在，金属蛋白酶的储存稳定性及其回收率均可显著地改善。相应地，这类酶在储存当中活性降低是极端轻微的，以致于该酶不仅可能长期使用或储存，而且也可以达到提高金属蛋白酶的回收率。这对于处理昂贵的酶在经济上尤其有利。

下面，将详细说明本发明。

打算用本发明方法处理的金属蛋白酶并无特定限制，但是对于嗜热菌蛋白酶类(中性)蛋白酶尤为有效。做为一种金属蛋白酶举例说由蛋白水解杆菌或硬脂酸嗜热杆菌产生的，或者通过其表达基因在其他宿主内产生的(金属蛋白酶)。用于本发明的酶溶液或淤浆可以是含许多杂质的粗制品或是提纯的制品。

在本发明方法中用作稳定添加剂的NPAA可以呈盐形式，例如NPAA的钠盐，或呈NPAA的结晶形式。如果希望的话，也可以使用含各种NPAA的溶液或淤浆，或者一种包括各种NPAA的混合物。总之，对NPAA并无特殊限制。NPAA造成的效果丝毫不因其中含有诸如其他氨基酸之类的有机物质或无机物质而变差。