[发明专利]二聚体块的合成及其在装配寡核苷酸中的应用

说明书

本发明涉及寡核苷酸的化学合成。尤其是，本发明涉及具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸的合成。

自从Zamecnik和Stephenson(Proc.Natl.Acad.Sci.75：280-284，1978)发现合成的寡核苷酸能抑制劳氏肉瘤病毒的复制以来，人们对使用寡核苷酸和具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸类似物来控制基因调节和处理病理状况表现出极大兴趣。

为了这种目的，已研究出多种方法用于合成寡核苷酸。早期的合成方法包括磷酸二酯和磷酸三酯化学方法。Khorana等(J.Molec.Biol.72：209，1972)公开了用于寡核苷酸合成的磷酸二酯化学方法。Reese(Tetrahedron Lett.34：3143-3179，1978)公开了用于合成寡核苷酸和多核苷酸的磷酸三酯化学方法。这些早期的方法已在很大程度上让位于更有效的亚磷酰胺和H-膦酸酯方法去合成。Beauca-ge和Caruthers(Tetrahedron Lett.22：1859-1862，1981)公开了在多核苷酸合成中使用脱氧核苷亚磷酰胺的方法。Agrawal和Zamecn-ik在美国专利No.5149798(1992)中公开了通过H-膦酸酯途径合成寡核苷酸的优化方法。

这两个现代方法都已被用来合成具有各式各样经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸。Agrawal和Goodchild(Tetrahedron Lett.28：3539-3542，1987)讲授了用亚磷酰胺化学方法合成寡核苷酸甲基膦酸酯(oligonucleotide mathylphosponatas)的方法。Connolly等(Biochemistry 23：3443，1984)公开了用亚磷酰胺化学方法合成寡核苷酸硫代磷酸酯(oligonucleotide phosphorothioates)的方法。Jager等(Biochemistry 27：7237，1988)公开了通过亚磷酰胺化学方法合成寡核苷酸氨基磷酸酯的方法。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：7079-7083，1988)公开了通过H-膦酸酯化学方法合成寡核苷酸氨基磷酸酯(oligonucleotide phosphoramidates)和硫代磷酸酯的方法。

亚磷酰胺化学合成法和H-膦酸酯化学合成法都是在存放于反应容器中的固体支持物上进行的。偶联每一个核苷酸必须的反应步骤包括脱三苯甲基、偶联、加帽和氧化。对于小规模合成(达到1μm摩尔)来说，增加一个核苷酸所需总时间约为6分钟。装配一个30个链节长的寡核苷酸可在180分钟内完成。在这些条件下，合成的寡核苷酸具有化学纯度和生物学活性。然而，当寡核苷酸以较大规模合成(达到1毫摩尔)时，在CPG上增加每一个核苷酸的时间约为50-60分钟，装配一个具有25个链节的寡核苷酸大约需要25小时。时间的增加是由于合成中使用的固体支持物的体积所致。周期时间的增加使已经被装配的寡核苷酸序列暴露于所有反应步骤(包括二氯乙酸步骤、偶联步骤、氧化步骤和加帽步骤)较长的时间。装配总时间的增加不仅影响该化合物的化学性质和生物学性质，也影响其产率。化学性质和生物学性质主要受脱嘌呤作用、碱基修饰等的影响。