[发明专利]牛生长激素的非变性效能的测定

说明书

背景技术

本发明一般地涉及牛生长激素(bST)。更具体地讲，本发明涉及以适于提供bST效能测定的方式从bST中分离生物活性bST蛋白部分的非变性方法。

近来重组DNA技术促进了bST的大规模生产。重组体微生物如重组体大肠肝菌在其细胞质内产生bST不溶粒。已知作为折射体成包涵体的这些不溶粒含有聚集的变性bST。这些折射体被回收并常用变性剂如盐酸胍，十二烷基硫酸钠或脲处理。变性剂将不适当地折叠的bST分子解开并使其增溶。之后，bST分子恢复形成适当地折叠的、生物活性的bST单体蛋白。

但是，由于这些变性和恢复步骤的效能差，也生成了某些不适当折叠的聚集体及非生物活性的bST聚集体。因此，所得bST疏松材料既含生物活性的bST单体也含非生物活性的bST聚集体。因此，在质量控制中建立一种测定bST效能的方法是非常重要的。

从前，bST效能由大鼠体重增加法评定。实质上，检测服用bST试样的大鼠体重的增加，并由此数据得到表示bST效能的数值。但是，该测定不能用于常规分析中精确定量地表示bST。bST效能也可由放射受体分析法(RRA)来测定。但RRA过于耗时。而且，RRA精确度低，因而通常要作数个实验，将其结果平均而得到bST效能值。

反相高效液相层析(RPHPLC)已被用于蛋白质的测定，但是，大部分已使用过的RPHPLC法都不适于bST效能的测量，这是由于在其流动相中使用可使bST变性的酸性介质和有机溶剂。

使用含十二烷基硫酸钠或盐酸胍作为流动相的粒度排阻(size exclusion)高效液相层析(“粒度排阻HPLC”)以前已被用于bST的测定。但是，由于其流动相使bST变性，因而该方法不是生物效能测定法。

因此，需要一种便利的、准确的和精密的非变性的测定bST的生物效能的方法。本发明致力于这些需要。

                   发明概要

本发明的一个优选方案提供了一种测定牛生长激素试样的效能的方法。该方法包括通过以具有大约5μm到约15μm平均粒径的亲水多孔聚合物凝胶作为固定相，以pH值约为8到约12的、对牛生长激素试样是非变性的缓冲水溶液作为流动相的粒度排阻HPLC测量牛生长激素试样中生物活性的牛生长激素蛋白的水平。牛生长激素试样的效能可根据该试样中所测的生物活性牛生长激素蛋白的水平而测定。

本发明的另一优选方案提供了一种将生物活性的牛生长激素部分从牛生长激素中分离的方法。该方法包括通过以具有大约5μm到约15μm平均粒子大小的亲水多孔聚合物凝胶作为固定相，以pH值约为8到约12的、对牛生长激素是非变性的缓冲水溶液作为流动相的粒度排阻HPLC从牛生长激素中分离生物活性的牛生长激素部分。

本发明的另一优选方案提供了一种处理疏松重组体牛生长激素，从疏松重组体牛生长激素中含有的非生物活性牛生长激素非共价可溶聚集体中分离生物活性的牛生长激素蛋白的方法。该方法包括将疏松重组体牛生长激素进行经过以具有大约5μm到约15μm平均粒子大小的亲水性多孔聚合物凝胶作为固定相，以pH值约为8到12的、对牛生长激素是非变性的缓冲水溶液作为流动相的粒度排阻HPLC的步骤，以便从非生物活性牛生长激素非共价可溶聚集体中分离生物活性的牛生长激素。

本发明提供了实现从非生物活性bST形式中便利分离生物活性bST蛋白的方法。该方法也很好地适用于bST样品的效能的便利的、准确和精密的测定。另外，使用本发明的方法首次实现了bST非共价可溶聚集体的分离和广泛的检定。本发明另外的目的、特征和优点将由本文的描述而明显地看出。

               附图的说明

图1A为用下文实施例所述的方法的生物活性bST参比标准的粒度排阻HPLC色谱图。

图1B到1E为用下文实施例所述的方法的疏松重组体bST材料的粒度排阻HPLC色谱图，并证明疏松材料中存在bST可溶聚集体。

图2A为表示碳酸氢盐缓冲液浓度对用下文实施例所述的方法的生物活性bST蛋白部分的粒度排阻HPLC的保留时间的影响的曲线图。

图2B为表示在下文实施例所述条件下碳酸氢盐缓冲液浓度对生物活性bST蛋白部分的粒度排阻HPLC峰面积响应值的影响的曲线图。

图3A为表示流动相pH值的变化对用下文实施例所述的方法的生物活性bST蛋白部分的粒度排阻HPLC的洗脱时间的影响的曲线图。