[发明专利]α-半乳糖苷酶

说明书

本发明涉及编码α—半乳糖苷酶及其具有α—半乳糖苷酶活性的变异体的DNA构建体、重组表达载体以及含有所说DNA构建体的细胞、以及使用重组DNA技术制备α—半乳糖苷酶制剂的方法。由本发明DNA构建体编码的α—半乳糖苷酶可特别地用于降解不同的植物产品中存在的α—半乳糖苷，或者也可以作为消化辅助药。

α—半乳糖苷酶是一众所周知的酶，它涉及水解例如用于营养目的的不同的重要植物或植物部分如豆科植物、蔬菜、谷类、谷类食物等中存在的α—半乳糖苷。α—半乳糖苷酶可由不同的微生物、植物和动物产生。然而，哺乳动物肠内的α—半乳糖苷酶的产生量不足，因此不能自身分解摄入的α—半乳糖苷，其肠中存在的微生物可代替它分解所摄入的α—半乳糖苷。这种微生物的分解作用对于摄入含α—半乳糖苷食物或饲料的哺乳动物通常会导致肠胃胀气进而引起消化不良。Rackis，J.J.于1975年详细讨论了α—半乳糖苷的生理作用。

为了克服与哺乳动物α—半乳糖苷酶不足有关的问题，食物或饲料中所含的α—半乳糖苷酶在摄入前已经过修饰，例如通过α—半乳糖苷酶作用的酶解修饰。可任选地，WO90/14101中建议α—半乳糖苷酶可用作消化辅助药。

已报道了细菌例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)(US3,846,239)、酵母菌例如啤酒糖酵母(Saccha-romyces cereviciae)(US4,431,737)、真菌例如链孢霉属(Neurospora)和根霉属(Rhizopus)的菌株(Worthington and Beuchat.1974)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(Cruz and Park，1982)、无花果曲霉(A.ficuum)(形态与A.niger相似)(Zapater et al.，1990)以及黑色曲霉(A.niger)(Bahl and Agrawal(1969 and 1972)、Christakopow-los et al.(1990)、Chun and Lee(1988)、Jung and Lee(1986)、Lee andwacek(1970)、Adya and Elbein(1976)、Kaneko et al.(1991))中α—半乳糖苷酶的产生。然而所有这些参考文献中只描述了通过常规发酵自然生成或经诱变的微生物菌株以产生α—半乳糖苷酶。

Overbecke等人于1990年描述了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中α—半乳糖苷酶的产生，而Aslandis等人于1989年描述了大肠杆菌(E、Coli)中的α—半乳糖苷酶。

由Novo Nordisk A/S、Denmark通过常规发酵制得的黑色曲霉α—半乳糖苷酶制剂(Alpha—Gal^TM)是可用的。与发酵黑色曲霉产生α—半乳糖苷酶有关的一个弊端是黑色曲霉在产生α—半乳糖苷酶的同时也产生了大量不需要的副产品草酸。

必需能够在产生黑色曲霉α—半乳糖苷酶制品的同时减少或除去草酸的产生，进而可增加所产生的α—半乳糖苷酶制品的产量和纯度。

本发明的目的是通过重组DNA技术来设计产生α—半乳糖苷酶的手段和方法，期望通过使用此技术比常规发酵技术可更节约、更大量地产生α—半乳糖苷酶而同时避免或减少所形成的草酸的量。

相应地，本发明一方面涉及含有偏码具α—半乳糖苷酶活性多肽的DNA序列的DNA构建体，其中DNA序列a)编码含有附加的SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多肽，或b)是a)DNA序列的类似物，它可

i)在下文限定的条件下，与附加的SEQ ID No.1或2所示的DNA序列，或者与根据所说DNA序列或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列制备的寡核苷酸探针杂交，和/或

ii)编码可与抗体反应的多肽，此抗体可与含有附加的SEQ IDNo.3所示氨基酸序列多肽的至少一个抗原决定簇反应，和/或

iii)编码与具有附加的SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多肽至少有50％相同的多肽。

SEQ ID No.1所示的核苷酸序列表示从黑色曲霉菌株中分离鉴定的完整α—半乳糖苷酶基因(包括内含子)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列是相应的cDNA序列，核苷酸序列将在下文的实施例中进一步描述，SEQ ID No.3所示的氨基酸序列是由SEQ ID No.2所示的DNA序列推导出的，它表示黑色曲霉包括其信号肽的α—半乳糖苷酶的氨基酸序列。

本发明的另一方面涉及含有本发明DNA构建体的重组表达载体以及或者含有DNA构建体或者含有本发明表达载体的细胞。