[发明专利]促进革兰氏阳性细菌中产生商业重要的外蛋白的方法和系统

说明书

                    发明领域

本发明涉及一种促进革兰氏阳性细菌，特别是杆菌属的菌种，生产工业上和医学上重要的外蛋白的方法和表达系统。

                    技术背景

革兰氏阳性细菌是通过细胞膜和细胞壁排出分泌的蛋白质，然后接着释放在外部基质中。另一方面，革兰氏阴性细菌是由两层细胞(或表面)膜包裹着，它们没有细胞壁。在革兰氏阴性细菌中，并没有把排出的大多数蛋白从细胞里释放出去，而是将其停留在内膜胞质空间和外膜中。

在大肠杆菌中已鉴定出这种分泌机制中的两种类型组分：可溶性胞质蛋白和膜相连蛋白(见综述，Wickner等(1991)Annu.Rev.Biochem.，60：101-124)。可溶性胞质蛋白，包括SecB和热休克蛋白，都可以防止所分泌蛋白前体折叠成与分泌物不相溶的构象。膜相连蛋白组包括周围膜蛋白SecA，整合膜蛋白SecY，SecE，SecD，SecF和信号肽酶Lep和Lsp(参见Hayashi，S.和Wu，H.C.(1990)J.8ioenerg.Biomembr.，22：451-471；Dalbey，R.E.(1991)Mol.Microbiol.，5：2855-2860)。这些膜相连蛋白参与与前体的结合和通过胞质膜的转运，然后分离信号肽并释放该蛋白。

有关革兰氏阳性细菌的分泌机理的知识是很有限的。在枯草杆菌(它是遗传上和生理上特征明显的典型微生物菌属)上获得的数据显示出与大肠杆菌上获得的数据完全相似，但也表现出在个组分的结构和特异性上的不同，这可能也反应出由各个细胞外膜的非常不同的组份和结构所设定的要求。

象枯草杆菌，解淀粉芽孢杆菌，地衣型芽孢杆菌这样的革兰氏阳性细菌具有很高的分泌蛋白能力，的确，工业上使用了许多杆菌的细胞外酶。由于在革兰氏阳性细菌中所分泌的蛋白在商业上如此重要，并且由于革兰氏阳性细菌所分泌的蛋白是通过与大肠杆菌非常不同的结构的细胞外膜来转移的，所以在革兰氏阳性细菌中蛋白分泌的分子理论是有相当学术价值的，并且在工业上很重要。

在这方面，我们近来发现枯草杆菌分泌机制的一种新组份，PrsA蛋白(Kontinen，V.P.和Sarvas，M.，(1988)J.Gen.Microbiol.，134：2333-2344；Kontinen，V.P.，等(1991)Mol.Microbiol.，5：1273-1283)。开始是用减少几种外蛋白分泌的非致死性突变来定义编码这种PrsA蛋白的PrsA基因。(Kontinen，V.P.和Sarvas，M.，(1988)J.Gen.Microbiol.，134：2333-2344)。基于克隆PrsA基因的DNA序列和有关该基因和蛋白的后续研究，我们认定PrsA能够编码一种作为伴随物的蛋白(PrsA)，并且它是通过细胞质膜转移的(起初的研究，见Kontinen，V.P.等，(1991)Mol.Microbiol.5：1273-1283)。已经发现PrsA蛋白具有一定量的序列与乳酸球菌的PrtM蛋白同源(30％左右)，其中PrtM蛋白是一种促进排出的丝氨酸蛋白酶成熟的一种蛋白(Haandrikman，A.J.，等(1989)J.Bacteriol.，171：2789-2794；Vos，P.，et al(1989)J.Bacteriol.，171：2795-2802)。我们也已发现PrsA蛋白的类似功能与细菌分泌机制的其它已知蛋白无关，这表明PrsA蛋白是蛋白分泌通道中的一种新型组份，这种组份促进革兰氏阳性细菌中的分泌蛋白在穿过细胞质膜后的释放，并且有可能折叠所分泌的蛋白。

因为在多数情况下，细胞内生产会导致所生产蛋白的聚集，相对来说排出的蛋白常常保留着它们的天然构象，所以在细菌中生产分泌形式的有意义蛋白是有优点的。在细菌中以分泌形式生产工业上和医学上的重要蛋白的其它优点在于这种分泌促进了蛋白产物的纯化。另外，与大肠杆菌不同的是，象杆菌这样的革兰氏阳性细菌不含有类似脂多糖的毒性化合物，这使得它们特别适合宿主来生产医学和药学上的蛋白。