[发明专利]哺乳动物细胞系和获得糖蛋白的方法

说明书

Epstein—Barr病毒是引起人类传染性的单核细胞增多症的病原体，这种病是年轻人中最常见的传染病之一。

90％以上的成人已受Epstein—Barr病毒感染。那些EBV阳性的人们以后可能发病如鼻炎癌、B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，某些何杰金(Hodgkin)淋巴瘤，并且可能发生其它的恶性疾病。已经报道，在原发感染或后继阶段发生慢性形式，稀有病例中，发生急性致死形式。

既然儿童中的Epstein—Barr病毒感染在临床上是难以察觉的，而且用表达Epstein—Barr病毒膜抗原gp250/350(BLLF—1阅读框，Baer等，1984)的重组疫苗病毒接种可以赋予对感染和/或疾病的抗性，必然假定，抵抗与Epstein—Barr病毒有关的疾病的疫苗是有可能的。

由于活疫苗的可能的副作用，开发纯蛋白疫苗是一个重要目标。既然Epstein—Barr病毒膜蛋白gp 250/350(BLLF—1)是高度糖基化的，并且这种翻译后修饰是正确免疫原性的重要因素(Emini等，1988)，那么，在可生产糖蛋白的真核生物细胞中以gp 250/350(Epstein—Barr病毒的阅读框BLLF—1)为基础开发疫苗是很有前景的。

本发明涉及哺乳动物细胞系，特别是稳定表达作为Epstein—Barr病毒抗原的糖蛋白(gp 250(220))，糖蛋白(gp 350)和/或杂交糖蛋白(gp 250(220)/(gp 350)的仓鼠细胞系(尤其是在无蛋白培养基中)，由此可避免通过补充培养基而受病毒或细菌污染的危险。本发明还涉及生产上述糖蛋白的方法。

稳定表达作为EBV抗原的gp 250(220)，gp 350和/或gp250(220)/gp 350的仓鼠细胞系是公知的；参见，例如，Motz等，在Gene，44(1986)，353—359和Vaccines，87(1987)，374—379，以及Gu Shyan等，在100 Jahre Blutserum—Therapie 1890—1990，Halle(Saale)，(1991)，93—100。然而，尚不知道可用来稳定地表达上述糖蛋白的仓鼠细胞系。根据Motz等，在Vaccines 87(1987)，374—379，376中的报道，病毒外源糖蛋白在CHO细胞膜中的整合超过某一点时，会是毒性的。

根据本发明的一个实施方案，通过下面的遗传学方法提出一种仓鼠细胞系，该细胞系稳定地表达和分泌上述糖蛋白，通过下述方法得到—用表达上述糖蛋白而不是膜锚蛋白(Membrananker)的载体转感细胞系(Motz等，1987)，—其中，载体含有一种细胞系所没有的选择标记，—培养细胞系，利用选择标记选择出一旦选择因子(抑制剂)被消除就能稳定地表达和分泌糖蛋白的细胞。

另外的实施例提出在无蛋白培养基中生产稳定地表达上述糖蛋白的仓鼠细胞系的方法的应用，它是通过下述步骤得到的(A)从没有选择标记的仓鼠细胞系(宿主细胞系)开始，该选择标记后来被按照(A)(d)染色体整合的载体表达，或被按照(B)染色体整合的载体表达(重组细胞系)，

(a)在含血清培养基中培养细胞，并使它们附着在底物上或相互附着，

(b)重复更换部分被消耗的培养基，同时逐步降低培养基的血清含量，最后对其进行无血清培养

在此

—不主动地消除细胞的附着，

—可选地，使细胞球形体形成和分开，分离分开的细胞球形体，在悬浮液中培养同时摇动，选择出在小团粒中生长的或单个生长的细胞

(c)最后，使选择出的细胞经过权利要求1的步骤，或者

(B)使如权利要求1所述的仓鼠细胞系经步骤(A)(a)至(A)(b)。

由于初始细胞系既不能在无血清培养基中转染也不能在无血清培养基中培养，所以使初始细胞系或宿主细胞系在含血清培养基中，例如在MEMα^-或α^-＋5％FCS中生长。这种培养基的例子是DIF1000，RPMI 1640，ASF 103和HDB。

为实现在无蛋白培养基中的生长，存在三个相互关联的问题。

1.例如，在使用培养瓶时，利用培养基血清消耗过程中的附着。这种方法的结果是正生长刺激。另外，消耗的旧培养基和死细胞以及溶胞作用的产物能被简便而温和地分离(不用离心)。

2.为确保血清消耗过程中培养基良好的自我调节能力，只重复更换部分培养基。