[发明专利]生产酶的方法

说明书

本发明涉及生产酶的方法及适用于该方法的细胞和DNA构建体。使用本发明的方法可使酶产量大量地增加。

酶作为能催化特异性反应的蛋白质分子，在广泛的工业和技术领域已发现有许多用途，这些领域包括去污剂工业、食品和饲料工业、纸浆工业及纺织工业。酶比通常用于同样或类似目的的化学试剂有许多重要的优点，一个优点是它们易于降解，因此，一般和化学试剂相比对环境污染较小。因此，许多目的酶被看作常规使用的化学试剂的具有魅力的替代物。

通常经过发酵具有天然地或作为被编码所述酶的核酸序列转化的结果可产生酶的微生物细胞或其它生物体细胞来生产酶。许多酶以无活性的酶原形式从生产酶的细胞中表达。表达的无活性的酶原典型地经过生产酶的细胞表达的一种或多种蛋白水解酶的作用进行加工转变成有活性的酶。以外部提供的活化剂进行的加工也有报道，例如以真菌金属蛋白酶对小牛凝乳酶前体的活化(Stepanov等，1990)。

虽然在酶的生产中在增加特异性酶的产量方面重组DNA技术的发展和运用是主要的突破，但是仍然有希望在产量方面取得进一步的提高，以此来满足诸如对酶不断增长的需要及改善酶生产的经济性。

现在令人惊奇地发现，当蛋白水解酶存在于发酵细胞的培养基中时，可能获得活性酶产量的大量提高，此活性酶以酶原的形式通过发酵能表达该酶原的细胞来产生。

因此，本发明涉及经过发酵以酶原的形式表达酶的细胞来生产活性酶的方法，该方法包括在能使酶原转变成有活性酶的蛋白水解酶存在的条件下进行发酵；从发酵的培养基中回收有活性的酶，在发酵前和/或发酵过程中，将蛋白水解酶加入发酵培养基中。

比较在蛋白水解酶(即降解蛋白质的酶)存在时预期产生蛋白质的情况，发现蛋白水解酶的存在导致酶产量的大量提高。更具体地说提高两倍多，例如与不加蛋白水解酶和典型地以所述宿主细胞表达的蛋白水解酶进行酶原活化的方法比较，以所述发酵生产的活性酶的量，提高4倍多、甚至高于6或8倍。

在本文中，术语“活性酶”意思是指表现出酶活性的酶的形式，例如成熟酶。酶的活性可以通过本领域已知的用于所述酶的方法来测定。

术语“酶原”意思是指酶的前体或前体形式。典型地，酶原由前肽和包含活性酶的氨基酸序列的多肽部分构成。酶原也可称为前体。在发酵培养基里酶原可以是稳定的，或与生产酶原的发酵培养基里的活性酶相比更不稳定，例如和活性酶相比，在发酵培养基里的酶原降解更快。

术语“蛋白水解酶”或“成熟酶”在本申请中可交替使用，其意思是指能从细胞表达的酶原切掉前肽的酶，以此实现从酶原向活性酶或成熟酶的转换。优选的蛋白水解酶不裂解或只在有限程度上裂解酶活性需要的活性酶的肽序列。蛋白水解酶可以是一种这样的酶，其特征是从所述的酶原切掉前序列以产生活性酶，根据本发明在此情况下，加入更多量的蛋白水解酶，或许不同于天然酶。

术语“发酵”意思是指任何培养细胞导致酶以酶原的形式进行表达的方法，所以发酵可理解为包括在适当的发酵培养基中，在使酶原得以表达的条件下，在实验室或工业发酵罐等水平上进行的摇瓶培养、少量或大规模发酵(包括连续的、成批的和成批加培养液的发酵)。

在第二方面，本发明涉及经发酵以酶原的形式表达酶的细胞来生产活性酶的方法，该方法包括在能将酶原转变成活性酶的蛋白水解酶存在的条件下进行发酵，从发酵培养基中回收活性酶、蛋白水解酶由存在于表达酶原的细胞中的重组DNA序列编码和表达。期望活性酶产量的提高类似于由上面说明的方法获得的那样，这种提高可根据本发明的该方面获得。根据该第二方面的方法有重要的优点在此操作过程中，无需加入蛋白水解酶，尽管它可能象其被下面进一步描述的那样。

在本文中术语“重组DNA序列”意思是指转化表达酶原的细胞所用的外源DNA序列。“术语”“外源”，意思是指表达酶原的细胞本身不含有的，编码蛋白水解酶的所述DNA序列。作为选择术语“重组DNA序列”意思是指在表达酶原的细胞中正常发现的，但被置于一个或多个调节元件(例如：启动子)控制之下的DNA序列，它不同于天然产生的DNA序列相关性序列，并能提高从该DNA序列表达的活性蛋白水解酶的量。而且，此术语意思是指DNA构建体，其中编码蛋白水解酶的DNA序列的拷贝数增加了。

本发明更进一步的方面还涉及包含编码酶原的核酸序列和编码能将酶原转变成活性酶的蛋白水解酶的核酸序列的重组宿主细胞，在所述重组宿主细胞中，至少有一个核酸序列是重组核酸序列。术语“重组”可用上面限定的方式理解。