[发明专利]具有乙酰酯酶活性的酶

说明书

发明的所属领域

本发明涉及具有乙酰酯酶活性的酶，生产该酶的方法，以及含有一种或多种所说酶的酶制剂。

发明的背景

各种生物学植物材料中，(主要在木聚糖、甘露聚糖和果胶聚合物中)，许多多糖均可以乙酰化形式存在〔1〕。乙酰基团的生物学意义尚不完全明了。已经知道，乙酰基团常常可防止多糖被水解酶降解。因此，为了实现部分或完全地酶促破坏乙酰化的多糖，使这些多糖去乙酰化是必要的〔2-4〕。

因此，有人预料〔2，3〕乙酰酯酶对于食品工业，主要在水果和蔬菜加工中如果汁生产、造酒或果胶提取中是一种重要的酶，其中可以利用它们的修饰乙酰化多糖成为易降解形式的能力。

已知许多真菌都含有能够使乙酰化的多糖去乙酰化的酶，这些酶通常被称为乙酰酯酶。已纯化了某些真菌乙酰酯酶〔5-9〕。然而，由于缺少充分鉴定特性的均一底物，以及检测乙酚释放的方法困难且耗时而阻碍了对这些酶的研究。迄今尚没有描述这些酶的工业应用。

WO92/19728描述了从真菌菌种棘孢曲霉(Aspergillumaculeatus)中分离的半乳糖醛酸-鼠李聚糖(rhamnogalacturonan)乙酰酯酶。该酶对果胶发状区域中的乙酰化半乳糖醛酸残基是特异的。EP507369描述了编码分离自黑曲霉(Aspergillusniger)之乙酰木聚糖酯酶的DNA序列。

为了许多目的，期望提供基本上没有其他成分的乙酰酯酶。以这种方式，有可能产生适于特殊目的的酶制剂，这些制剂可含有单一乙酰酯酶或其随意组合，并可含有或不含其他多糖降群酶。为此目的，方便的办法是使用重组DNA技术制取单一成分的乙酰酯酶。

发明的概要

现令人惊奇地发现，除上述半乳糖醛酸鼠李聚糖乙酰酯酶外，真菌菌种棘孢曲霉还产生许多具有有用酶促活性的新的乙酰酯酶。尽管这些酶只是以很低的量(占总的酶产生量的0.1％以下)产生的，但本发明人已成功地纯化并从性质上鉴定了这些新的酶。

因此，本发明涉及具有乙酰酯酶活性的新的酶，特别是涉及单一成分的乙酰酯酶。

更具体地说，本发明的第一个方面涉及具有乙酰酯酶活性的酶，该酶包含序列表SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列，其中X代表任何一种氨基酸残基。

本文所使用的术语“具有乙酰酯酶活性”是指一组酶，其成员具有能够按下文材料和方法部分中给出的程序裂解乙酰酯酶底物一对位硝基苯酚乙酸酯(PNP-乙酸酯)这一共有特征。再者，在某些情况下它们也可能作用于其他乙酰化非糖底物。这些酶统称为乙酰酯酶。可以理解到，本文公开的各种乙酰酯酶的天然底物在不同的乙酰化多糖，例如乙酰化甘露聚糖、乙酰化木聚糖、乙酰化半乳糖醛酸-鼠李聚糖及乙酰化果胶间可能有所变化。

在进行导致本发明的研究工作中，令人惊奇地发现，由棘孢曲霉中分离的不同的乙酰酯酶包含SEQ ID NO.1中所示的部分氨基酸序列。该序列的存在可能是乙酰酯酶，特别是由棘孢曲霉或其他相关生物产生的乙酰酯酶的特征。如上所述，X可以是任何氨基酸残基，其在本文中可被理解为包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰按、天冬氨酸、半脘氨酸、容氨酰胺、容氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、卤氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

第二个方面，本发明涉及具有乙酰酯酶活性的酶，该酶是对乙酰化木聚糖及乙酰化甘露聚糖有活性的。据本发明人所知，以前尚没有公开过对这两种底物都有活性的酶。因此，已知乙酰酯酶是很特异的，因为它们只使一种类型的乙酰化碳水化合物去乙酰化。根据本发明的这一个方面的乙酰酯酶的优点是，它可用于一种以上类型的底物。

本文使用的术语“对乙酰化的木聚糖的活性”和“对乙酰化的甘露聚糖的活性”，意思是指该酶能够分别水解见于乙酰基团与木聚糖之间和乙酰基团与甘露聚糖之间的酯键。

本发明的再一个方面涉及具有乙酰酯酶活性的酶，该酶与对抗衍生于棘孢曲霉，CBS101.43纯化的乙酰酯酶的抗体发生免疫学反应并具有约44或35DKa的分子量。