[发明专利]核酸的衔接线性扩增

说明书

发明的背景

1.技术领域

本发明与核酸的体外复制有关。更确切地说，本发明涉及一种用于所感兴趣核酸序列的复制的方法，最终通过引物延伸反应的衔接产生大量所感兴趣的的序列，其中所感兴趣序列以算术线性方式积聚起来。

2.背景技术的简述

核酸的大量复制(如今称为核酸“扩增”并在本文中使用该术语)在实践和理论上具有广泛的用途。H.G.Khorana与其合作者首先提议了用于体外DNA扩增方法，以产生足量的双链DNA(酵母的主要丙氨酸t-RNA基因的部分序列)，这种双链DNA已经通过酶反应将合成的DNA连接而产生。见K.Kleppe等；J.Mol.Biol.56：341-361(1971)。后来，体外扩增被应用到基因组DNA的扩增(Sakaki等，Science 230：1350-1354(1985))，称为今天所知的聚合酶链反应或“PCR”。通过来源广泛的合成的寡核苷酸引物、热稳定DNA聚合酶和自动化温度循环装置，PCR成为分子生物学家广泛应用的工具。

PCR在文献中被称为是“指数扩增”过程。在引物延伸的每一轮或“循环”中，合成了为其它引物结合的引物结合位点，如此，每一个在前一个循环合成的DNA分子将被用作引物依赖的复制的模板。该方法的这一方面，配合存在足够大量的引物分子，随着反应的持续，结果合成的DNA以数学指数方式积聚。

对分子生物学家来说，虽然PCR已被证明是一项有用的技术，并且在人类遗传研究、诊断和法医学甚至在测定抗体方面已得到广泛的应用，然而仍然察觉到其缺点。PCR方法很难准确地定量，这主要由于在每一个循环中扩增的产物呈指数增加。PCR的产物，即双链DNA分子本身难于分析和测序。在测序或其它需要单链的下游处理，例如与探针杂交检测感兴趣的序列之前，都需要进行链的分离。

PCR方法还被证明对前期扩增的DNA序列转移到新反应时所产生的污染特别敏感。这个问题似乎是由于这些事实引起：(1)在任何一个设定的反应循环中产生的大量的DNA，和(2)这个方法使用所有的产物DNA链作为后来的循环的模板。即使是微量的污染DNA也会呈指数扩增，并导致错误的结果。见Kwok和Higuchi，Nature339：237-238(1989)。由于这些污染问题被广泛认识，各种不同的降低这种污染的方法已在文献中屡见报道(如，化学去污染法、物理处理、酶学处理和采用封闭系统)。见John B.Findlay，“Development of PCRfor in vitro Diagnostics，”presented at“Genetic Recognition，”Nov.20，1992，San Diego，CA.

一直需要核酸(DNA)扩增的新方法，该方法应能提供大量DNA或只是选择性地扩增需要的特异序列，并避免目前伴随“PCR”反应的问题。特别是需要一些最终产生大量所感兴趣的核酸分子，或大量的含有所感兴趣核酸序列的核酸分子，但对污染的核酸的存在相对不敏感的核酸扩增的方法。并且还需要求产生单链产物的核酸扩增方法。

本发明的概述

本发明满足了前述的和其它需要，一方面它提供了用于扩增标本中所含的互补核酸链中所感兴趣的特异核酸序列的方法，所述的方法包括下列步骤：

(a)在一定条件下，将链与含有非复制性因子的引物接触，以所述的链为模板合成第一代引物延伸产物，其中链的引物是如此选择的，即它所产生的第一代链在与模板分离后能成为互补链引物的模板，合成第二代引物延伸产物；

(b)将第一代引物延伸产物从它们的模板上分离出来，产生单链分子；以及

(c)在一定条件下用(a)步骤的引物处理第一代引物延伸产物，使用第一代引物延伸产物为模板合成第二代引物延伸产物；

其中，第二代引物延伸产物至少含有所感兴趣核酸的部分序列，并且不能作为引物的模板来合成延伸产物，所述的引物延伸后合成它们的模板。

在本发明的其它方面，(c)步的产物分离开来产生单链分子，整个方法至少重复一次。随着本方法在程序化的热循环装置控制下以自动方式完成，(c)步骤优选是重复多次。