[发明专利]通过3－(羧乙硫基)丙酰－7－ADCA有效生产7－ADCA的方法

说明书

本发明涉及制备和回收7-氨基去乙酸头孢烷酸(7-ADCA)的生物合成方法。

β-内酰胺抗生素构成最重要的一类抗生素化合物，并具有悠久的临床应用历史。这类抗生素中，突出的有青霉素和头孢菌素。这些化合物分别由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和产黄枝顶孢(Acremonium chrysogenum)天然产生。

经过经典的菌种改进技术，使产黄青霉和产黄枝顶孢的抗生素生产水平比过去几十年大大提高了。随着对产生青霉素和头孢菌素的生物合成途径的了解增多和重组DNA技术的出现，现在有了改进生产菌株和将这些化合物体内衍生化的新工具。

β-内酰胺生物合成中涉及的大部分酶已得以鉴定，对其相应基因已进行了克隆，如见Ingolia和Queener的Med.Res.Rev.9(1989)，245-264(生物合成途径和酶)，及Aharonowitz，Cohen和Martin的Ann.Rev.Microbiol.46(1992)，461-495(基因克隆)。

产黄青霉中青霉素生物合成的头两步是：三种氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)缩合成三肽LLD-ACV，然后该三肽环化形成异青霉素N。该化合物含有典型的β-内酰胺结构。第三步涉及通过酰基转移酶(AT)的作用以疏水侧链交换L-5-氨基-5-羧基戊酸的亲水侧链。在生产青霉素G的工业方法中，选择的侧链是苯基乙酸(PA)。EP-A-053 2341中公开了己二酸(5-羧基戊酸)原料的应用。掺入该底物导致产生了具有5-羧基戊酰侧链的青霉素衍生物，即5-羧基戊酰-6-氨基青霉烷酸。这种掺入是由于已证明酰基转移酶具有宽的底物特异性(Behrens等，J.Biol.Chem.175(1948)，751-809；Cole，Process.Biochem.1(1966)，334-338，Ballio等，Nature 185(1960)，97-99)。如EP-A-0448 180中所述，由AT介导的酶促交换反应发生在一种细胞器—微体中。

头孢菌素比青霉素贵得多。一个原因是一些头孢菌素(如cephalexin)是由青霉素经若干步化学转化而制得的。另一个原因是迄今只能发酵出具有D-5-氨基-5-羧基戊酰侧链的头孢菌素。在此方面迄今最重要的起始物头孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，这就意味着使用麻烦而又昂贵的柱技术进行费时费钱的分离工艺。这样获得的头孢菌素C须经若干化学和酶促转化才能转变为治疗用头孢菌素。

中间体7-ADCA现今是青霉素G经化学衍生而产生。产生7-ADCA需要的化学步骤涉及5-元青霉素环结构扩环成为6-元的头孢菌素环结构。但来自丝状细菌带棒链霉菌(StreptomycesClavuligerus)的扩环酶可以进行这种环扩张。当被引入产黄青霉中时，它能将青霉素环结构转变为头孢菌素环结构，如Cantwell等在Proc.R.Soc.Lond.B.248(1992)，283-289；及EP-A-05 32341和EP-A-0540210中所述。已对扩环酶从生化和功能方面进行了充分表征(EP-A-0366354)，也对其相应的基因进行了表征。已描述了cefE基因(EP-A-0233 715)和DNA序列的物理图谱。及cefE在产黄青霉中的转化研究。

适当扩环酶的另一来源是丝状细菌Nocardia lactamdurans(早期称为Streptomyces lactamdurans)。已描述了酶的生化特征和基因的DNA序列(分别见Cortes等，J.Gen.Mierobiol.133(1987)，3165-3174；及Coque等，Mol.Gen.Genet.236(1993)，453-458)。

更具体地讲，EP-A-053 2341描述了扩环酶结合5-羧基戊酰侧链作为原料在产黄青霉中的应用，5-羧基戊酰侧链用作产黄青霉中酰基转移酶的底物。这导致形成5-羧基戊酰-6-APA，后者通过引入产黄青霉株中的扩环酶产生5-羧基戊酰-7-ADCA。最后，建议去除5-羧基戊酰侧链生成终产物7-ADCA。专利申请EP-A-0540210描述了制备7-ACA的相似方法，包括将ADCA环的3-甲基侧链转变为ACA的3-乙酰氧甲基例链的额外步骤。但上述专利申请没有提供经济有效的方法，因为首先没有认识到扩环酶在细胞中及时表达与酰基转移酶的表达同时进行的问题。