[发明专利]蛋白质的纯化

说明书

本发明的技术领域

本发明涉及蛋白质纯化领域。特别是，涉及应用固定的金属亲合层析技术纯化补体受体蛋白质。本发明的背景技术

以往，纯化蛋白质的方法是由这种欲纯化蛋白质与废弃蛋白质杂质分子的大小、电荷和溶解性这些性能的不同所决定的。基于这些参数的方法包括分子排阻层析法、离子交换层析法和差示沉淀法等。

分子排阻层析法，也可以称做凝胶过滤层析法或凝胶渗透层析法，它的机理是流动相中的大分子渗透到固定相颗粒的孔隙中。渗透差是颗粒的流体动力学体积的函数。因而，在理想的条件下，当小分子进入到颗粒体内时大分子被排阻到颗粒外部。洗脱容积与分子量的对数呈线性关系，所以可以根据蛋白质的大小确定洗脱顺序。分子排阻层析法的支持剂主要为交联葡聚糖如SEPHADEX^，珠状琼脂糖颗粒如SEPHAROSE^(二者均可在瑞典Pharmacia AB.Uppsala买到)，交联聚丙烯酰胺如BIOGEL^(可从加利弗尼亚，Richmond，BioRad药厂买到)，或乙二醇异丁烯酸共聚物如TOYOPEARL HW65S(可从日本东京ToyoSoda买到)。它们都可用于本发明的实施。

沉淀方法取决于在蛋白质粗混合物中各个蛋白质的溶解性可能存在的极大的不同。尽管蛋白质在水介质中的溶解性受多种因素影响，但为讨论起见，通常认为：如果蛋白质与溶剂间的相互作用强于与相同的或类似的蛋白质分子间的相互作用则这种蛋白质为可溶性的。不局限于任何描述沉淀现象的特殊机制学说，有人认为：蛋白质与水分子间的相互作用是通过氢与几种无电荷基团结合以及氢与带电荷基团静电结合为偶极而产生的，沉淀物如单价阳离子的盐(如硫酸铵)与蛋白质竞争水分子，因此，在高盐浓度下蛋白质“脱水”，与水之间的相互作用减弱，与相似蛋白质的聚集增加，导致从介质中沉淀出来。

离子交换层析法涉及样品中的带电官能团与带相反电荷的离子官能团在吸附表面的相互作用。已知有两种普通类型的相互作用。阴离子交换层析法是通过带负电荷的氨基酸支链(如天冬氨酸和谷氨酸)与带正电荷的吸附表面产生相互作用而完成的，阳离子交换层析法是通过带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸和精氨酸)与带负电荷的吸附表面产生相互作用而完成的。

最近开发的亲合层析技术和疏水性相互作用层析技术进一步补充了较为传统的分子排阻层析法和离子交换层析法。亲合层析的依据为蛋白质与一种固定配体间的相互作用。在这种配体为一种底物，底物类似物，抑制剂或抗体的情况下，它对于特殊蛋白质能是特异的。另一方面，这种配体还可以与大量的蛋白质发生反应。象一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟碱腺嘌呤二核苷酸或某种染料的常用配体均可用于回收一种特殊类型的蛋白质。这种亲和层析法中至少的生物特异性之一是固定的金属亲合层析技术(IMAC)也可以称作金属螯合层析法。Porath et al.，(Nature 258：598-99(1975)中介绍的IMAC涉及将一种金属与一种固体支持剂螯合，然后与欲分离蛋白质表面的电子供体氨基酸残基形成一种复合物。

疏水性相互作用层析法的首次开发源于一种观察即蛋白质可在包含有碳氢化合物连接臂(spacer arm)但不含有亲合配体的亲合凝胶上保留。尽管在本领域中有时使用疏水性层析法的名称，但较好的名称为疏水性相互作用层析法(HIC)，因为这种溶液与凝胶之间的相互作用是疏水性过程而不是色谱分析过程。在高离子强度下疏水性相互作用非常强，因此，在盐沉淀或离子交换之后很容易完成这种形式的分离。通过改变溶剂、pH值、离子强度或者通过加入高离液序列或有机调节剂如乙二醇能够实现从HIC支持剂上的洗脱。有关疏水性相互作用层析法的基本原理的描述可以在美国专利3,917,527和美国专利4,000,098中看到。下列的公开的参考文献中举例说明了HIC在纯化特异性蛋白质中的应用：人的生长激素(美国专利4,332,717)，毒素共轭物(美国专利4,771,128)，抗溶血因子(美国专利4,743,680)，瘤坏死性因子(美国专利4,894,439)，白细胞介素-2(美国专利4,908,434)，人的淋巴毒素(美国专利4,920,196)和溶菌酶种类(Fausnaugh，J.L.和F.E.Regnier，J.Chromatog.359：131-146(1986)。

本发明是将离子交换法，IMAC，HIC和分子排阻层析法结合起来用于补体受体分子和补体受体相似分子的纯化。本发明的简单描述