[发明专利]来自真菌的α-1，4-葡聚糖裂解酶，其纯化，基因克隆和在微生物中的表达

说明书

本发明涉及一种酶，特别是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)。本发明还涉及提取该酶的方法。

FR-A-2617502和Baute等在Phytochemistry[1988]Vol.27No.11pp3401-3403中报道了以明显的酶促反应在普通羊肚菌(Morchella vulgaris)中生产1，5-D-脱水果糖(“AF”)。AF的产量相当低。尽管提及了可能的酶促反应，但这两份文献都没有提供任何酶的任何氨基酸序列资料，更不用说任何核苷酸序列资料。这些文献说到AF可作为制备抗生素羟基羟甲基吡喃酮的前体。

Yu等在Biochimica et Biophysica Acta[1993]Vol.1156pp313-320中报道了从红海藻中制备GL和其降解α-1，4-葡聚糖以生产AF的用途。AF的产量相当低。尽管该文献提及了GL酶，但未提供该酶的任何氨基酸序列，更不用说编码该酶的任何核苷酸序列资料。该文献还建议GL的来源就是藻类。

根据本发明，提供了一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含从真菌培养物中分离该酶，其中，该培养基本上不含任何其它生物体。

优选使用不会被该酶降解的凝胶分离和/或进一步纯化该酶。

优选的是凝胶以糊精或其衍生物为基础，优选环糊精，更优选β-环糊精。

根据本发明，还提供了一种以本发明的方法制备的GL酶。

优选的真菌是Morchella costata或普通羊肚菌(Morchellavulgaris)。

优选该酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2，或其任意变异体。

术语“其任意变异体”指在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对该序列一个氨基酸的任意取代，改变，修饰，置换，缺失或增加。

根据本发明，还提供了编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，优选其中的序列不存在于其天然环境中(即不构成表达该酶的细胞生物体天然基因组的一部分)。

优选的核苷酸序列是DNA序列。

优选的DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源或含任意合适的密码子取代的序列。

“基本上同源”的表达包含有关结构和/或核苷酸成份和/或生物活性的同源性。

“含任意合适的密码子取代”的表达包含用另一编码相同氨基酸的密码子进行的任何密码子置换或取代或在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对其进行的任何增加或删除。

换句话来说，本发明也包含修饰的DNA序列，其中至少一个核苷酸已缺失，取代或修饰，或者其中至少插入了一个额外的核苷酸以编码具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，优选酶具有增强的裂解酶活性。

根据本发明，还提供了制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含表达本发明的核苷酸序列。

根据本发明，还提供了使用β-环糊精来纯化酶，优选GL。

根据本发明还提供了一种核苷酸序列，其中的DNA序列由至少一种与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源，或含任意合适的密码子取代的序列构成，优选其中的序列是一种分离的形式。

因此，本发明涉及从真菌中分离α-1，4-葡聚糖裂解酶。例如，真菌可以是Discina perlata，Discina parma，Gyromitra gigas，Gyromitra infula，Mitrophora hybrida，尖顶羊肚菌，Horchellacostata，弹丝羊肚菌，Morchella hortensis，Morchella rotunda，普通羊肚菌，疣孢褐盘菌，Sarcosphaera eximia，Disciotisvenosa，Gyromitra esculenta，卷曲马鞍菌，空隙马鞍菌，Leptopodia elastica，指状钟菌，和羊肚菌属的其它形式之任一。优选的真菌是Morchella costata或普通羊肚菌。

可用Yu等(出处同上)描述的方法进行酶的初步纯化。

然而，优选的酶初步纯化包括一种最优化的程序，其中使用在纯化步骤中不会分解的固相支持物。这种凝胶支持物还具有与标准实验室蛋白质纯化装置相匹配的优点。

这种最优化的纯化方法的详情在下文给出。以已知的蛋白质纯化标准技术终止纯化。

使用互补电泳技术可易于测定酶的纯度。

根据pI，温度和pH最适值鉴定了纯化的裂解酶GL。