[发明专利]突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其基因，和氨基酸的生产方法

说明书

                      技术领域

本发明涉及突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，编码它的基因，及氨基酸的生产方法，更详细地说它涉及一种具有使天冬氨酸的反馈抑制失敏的突变的基因及其应用。

                     背景技术

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是一种见于大部分细菌和所有植物的酶。本酶的作用在于天冬氨酸和谷氨酸的生物合成，并为柠檬酸循环提供C4二羧酸以维持其流动。然而，在使用衍生物发酵生产氨基酸的过程中，对该酶的效果报导很少，其重要性尚不明确(Atsushi Yokotaand Isamu Shiio，Agric.Biol.Chem.，52，455-463(1988)，Josef Cremer et al.，Appl.Environ.Microbiol.，57，1746-1752(1991)，Petra，G.Peters-Weintisch，FEMS Microbiol.Letters，112，269-274(1993))。

另外，氨基酸是一种作为蛋白质成分广泛存在于细胞内的化合物，然而，为了经济的能量代谢和物质代谢，其生产被严格控制。该控制主要是反馈控制；其中代谢途径的最终产物抑制催化该途径前面步骤的一种酶的活性。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶在其活性表达方面亦受各种调节。

例如，就属于棒状杆菌属和埃希氏杆菌属的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来说，其活性被天冬氨酸抑制。因此，前面提及的，有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶参予的氨基酸生物合成，也被天冬氨酸抑制。

在先有技术中，开发了多种技术以在氨基酸发酵中进行有效生产，通过使用转化为对反馈控制失敏的突变株已实施亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等的发酵生产。然而，迄今为止，既没有转化为对天冬氨酸抑制失敏的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，也没有试图使用它进行天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸的发酵生产。

另一方面，ppc基因，即一种编码大肠埃希杆菌(EscherichiaColi)的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因已被克隆，并已测定其碱基顺序(Fujita，N.Miwa，T.Ishijima，S.，Izui，K.和Katsuki，H.，J.Biochem.，95，909-916(1984))，然而，即或在同种酶中，也还无对天冬氨酸的抑制失敏的变异型的报导。

本发明基于前面提及的观点，其目的是提供一种对天冬氨酸的反馈抑制基本失敏的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，编码它的基因，和它的应用。

              发明的公开

为完成前面提及的目的，本发明者进行了勤奋研究，结果发现，通过用其他氨基酸置换大肠埃希杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的特殊位点上的氨基酸，可以使天冬氨酸的抑制基本失敏，成功地得到了编码该突变型敏的基因，从而完成了本发明。

也就是说，本发明在于一种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，它来源于一种属于埃希杆菌属的衍生物，其特征在于其中具有使天冬氨酸的反馈抑制失敏的突变，以及编码该突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA序列。

本发明进一步提供包含该DNA片段的属于埃希杆菌属或棒状杆菌的微生物，以及生产氨基酸的方法，其特征在于在适宜的培养基中培养这些微生物的任何一种，并将选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸的氨基酸从培养基中分离出来。

另外，在本说明书中，编码该变异体磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA序列或除此之外还包含启动子的DNA序列有时仅称为“本发明的DNA序列”，“突变型基因”或“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因”。

本发明在下文中将被详细说明。<1>突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶

本发明的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下简称为“变异型酶”)为属于埃希杆菌属的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，它具有使天冬氨酸的反馈抑制失敏的突变。

该突变可为任一使前面提及的反馈抑制基本失敏而不丢失磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的酶活性者。例如，当具有突变的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶存在于埃希杆菌属微生物的细胞中时，这样的突变可使细胞对具有下述特性的化合物具有抗性：

对产生野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的属于埃希杆菌属的微生物表现生长抑制作用；

在L-谷氨酸或者L-天冬氨酸存在下前述生长抑制作用恢复；并且

抑制野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。

更具体地说，从磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端计算，可有列举：