[发明专利]一种通过层析法制备含因子VIII的病毒灭活级分的方法

说明书

本发明涉及一种通过层析法制备含因子VIII的一种病毒灭活级分的方法，以及一种可通过按照本发明的方法得到的含因子VIII的级分。

因子VIII是一种在血凝中起重要作用的至关重要物质。血凝疾患因此可通过施用因子VIII治疗。因而，对可施用的因子VIII制剂的需求很大。已作了很多尝试以便从自然来源分离高度富含形式的因子VIII。因此，用于从冷沉淀物提纯因子VIII的层析法已是公知的。冷沉淀物是对血浆进行冷沉淀得的一种成分。EP 367840B1涉及一种从血浆中分离因子VIII而不预先进行冷沉淀的层析法。在经离子交换基团修饰的亲水性材料上经层析分离法分离该含因子VIII的成分。EP 0238701涉及一种用于制备超纯的、易传播的抗血友病因子的方法，其中经预处理的级分是一种用乙醇沉淀法从纤维蛋白原、球蛋白、白蛋白和其它干扰成分中分离的冷沉淀物。欧洲专利申请88108458.6描述了在冷沉淀物级分的病毒灭活后用离子交换器层析进行分离。EP 0173242A描述了在仅基于碳水化合物的阴离子交换材料上通过层析法取得因子VIII制剂的方法，该碳水化合物基质被DEAE基团修饰。特别地，DEAEsepharose和DEAE纤维素按照用途被描述。在GB-A-1178958中，描述了一种使用ECTEOLA纤维素柱的因子VIII提纯法。该被修饰的纤维素包含由表氯醇和三乙醇胺反应引入的基础物质。上述先有技术应用批量层析或柱层析的形式进行层析分离。虽然用这些方法得到了相当好的结果，为经济的和伦理的原因还希望增加有生物学上价值的因子VIII的产量。

因此，构成本发明基础的技术问题在于提供一种方法，该方法从先有技术出发，能够在使因子VIII的制备在产量和生物活性方面得到提高。

令人惊异地，该问题已得到解决。以冷沉淀物或血液血浆为出发材料，可选择随后进行氢氧化铝处理，将冷沉淀物溶解后使用膜层析法进行分离。

本发明涉及方法的实施可采用商品冷沉淀物或血液血浆。优选地，将解冻的冷沉淀物用氢氧化铝处理，目的是对样品进一步预提纯以便预浓缩因子VIII。

优选地，在实际进行层析纯化之前，对排列在膜内或膜上的材料进行病毒灭活。该病毒的灭活按照在EP 131740A1中描述的方法通过用生物相容的有机溶剂(去垢剂)，Triton×100/TNBP，优选吐温/TNBP(三-n-丁基磷酸盐)处理而进行。采用Natriumcholat/TNBP也得到很好的结果。优选地，去污剂的用量最多达15％重量比。然而，病毒的灭活也可在用膜层析法分离后进行。

为提纯样品中的因子VIII，层析步骤可在经离子交换基团，特别是阴离子交换剂修饰的基础材料上进行，或在经免疫亲和配基修饰的材料上进行。关键的是，所述这些材料都是排列在膜上的优选地，这些膜由基底材料如经修饰的纤维素或塑料纤维制成。特别适用的是膜，和由多孔的多聚物(甘油基甲基丙烯酸树脂)和/或其它具有类似结构的多孔亲水聚合物和亲水聚苯乙烯所制成的致密盘。

在第一种情况，适用于分离的膜或者由用纤维素或塑料纤维制成的堆积的薄膜组成，或者在第二种情况下它由用二氧化硅凝胶或多聚物载体制成的致密盘组成。该膜或盘的基底材料提供相应的阴离子交换基团或免疫亲和配基。特别地，阴离子交换基团如季胺或二乙胺乙基基团被当作离子交换基团。阳离子交换剂一般采用弱的和强的酸性阳离子交换剂，例如被磺酸或磷酸基团修饰的材料。

该离子交换基团可结合在基底材料纤维上，带或不带所谓的隔离物。提供隔离物的材料也被称为触须材料(Tentakelmaterial)。在DE 4204694中提到了相应的隔离物和配基。例如，一种糖胺残基也可用作一个隔离物。阴离子交换基团如DEAE或季胺也可结合在由多孔多聚物(甘油基甲基丙烯酸树脂)或其它被提及的材料制成的膜上。该阴离子交换基团的结合可直接在形成膜的材料上，也可通过一个隔离物如糖胺残基发生。

在本发明涉及的方法的另一实施方案中，使用了应用具有对因子VIII的高度亲和性的固定物质的亲和膜层析法。特别地，可能采用单克隆和/或多克隆抗体或抗体的因子VIII结合片段(免疫亲合膜层析)。优选该抗体来自人或鼠。