[发明专利]具有抗血栓活性的肽及其制法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抗血栓活性的肽及其制法，以及含有该肽的医药组合物，具体地说，涉及一种在活体内不会造成血小板减少的，得自蛇毒的肽。

背景技术

众所周知，以心肌梗塞、脑血栓为首的所谓血栓症的发病，与血小板有密切关系(“血小板”；山中、山崎编；医学书院，P158-163(1991))。近年来，就被视为导致这种血栓症的初期反应的血小板在血管内皮下组织的粘着而言，已有人指出，血中蛋白质之一的von Willebrand因子与血小板表面上的糖蛋白质Ib的结合是重要的(J.P.Cean等人，J.Lab.Clin.Med.，87，586-596(1976))。

这两种蛋白质的结合在一般状态下不会发生，已知，只有在活体内处在高剪切应力的状态下才会发生(T.T.Vincent等人，Blood，65，823-831(1985))。此外，作为在活体外观察这种结合的方法，使用抗生素瑞斯托菌素(ristocetin)(M.A.Howard，B.G.Firkin，Thromb.Haemostasis，26，362-369(1971))、得自蛇毒的蛋白质botrocetin(M.S.Read等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，4514～4518(1978))等物质的方法，已被广泛使用。把这些物质添加到血小板悬浮液中会引起血小板凝集，但这种凝集取决于von Willebrand因子与糖蛋白质Ib的结合(上述M.A.Howard，B.G.Firkin，M.S.Read等人)。

对于由上述瑞斯托菌素或bortocetin所造成的血小板凝集能显示抑制作用的若干种化合物，已有人报告。例如，已知有金精三羧酸(M.D.Phillips等人，Blood，72，1989-1903(1988))、芳香族脒基化合物等色素物质(J.D.Geratz等人，Thromb.Haemostasis，39，411-425(1978))，以及von Willebrand因子或糖蛋白质Ib的部分片段肽等(Y.Fujimura等人，J.Biol.Chem.261，381-385(1986)，K.Titani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84，5610-5614(1987))。

此外，已有人报告从蛇毒中也可获得同样具有血小板凝集抑制活性的肽，WO 9208472号国际公开手册中记载，响尾蛇(Crotalus horridus horridus)蛇毒及Cerastes cerastes蛇毒都有由至少N末端氨基酸序列同源性高、分子量约为25千道尔顿的两条不同的链构成的肽。Peng等人(M.Peng等人，Blood，81，2321-2328(1993))也报告，得自小蝰蛇(Echis carinatus)的血小板凝集抑制肽，在离体活性、分子量等方面也与上述肽非常类似。这些得自蛇毒的血小板凝集抑制肽，在离体试验中，均能以2-5μg/ml以下的低浓度抑制瑞斯托菌素或botrocetin所引起的血小板凝集。

在WO 9208472号国际公开手册中，并未提到动物给药时的抗血栓性。因此，如本发明书的实施例1所示，发明人考虑了该手册中所记载的得自响尾蛇(Crotalus horridushorridus)蛇毒的肽的纯化法，并对与所记载的肽具有同源性质的肽进行纯化，探讨了其对给药时的作用。结果观察到，在100μg/kg这样少量的给药时，血液中的血小板就几乎完全消失。然而，WO 9208472号国际公开手册中，并未指出对动物给药时存在的这一问题及其解决办法。

此外，Peng等人从小蝰蛇(Echis carinatus)蛇毒得到的肽，也是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的分子量在非还原条件下约为26千道尔顿而在还原条件下约为14千道尔顿及约16千道尔顿的两种肽，因此可以推断是与上述得自响尾蛇(Crotalus horridus horridus)蛇毒的肽相同，但据报告，在这种肽对动物给药时也观察到显著的血小板减少(M.Peng等人，Blood，81，2321-2328(1993))。

得自蛇毒、可抑制von Willebrand因子与血小板结合的肽，其氨基酸序列的同源性均高，分子量也非常类似，由上述结果可推论这些肽兼备有在活体内引起血小板减少的活性。亦即，这些肽在离体试验中虽可以低浓度抑制vonWillebrand因子与血小板结合，但是，却难以用来作为对活体给药的抗血栓药。本发明人，就引起血小板减少的机制进行如下考虑。