[发明专利]用于将预定的改变引入靶基因中的化合物

说明书

本申请是于1993年12月9日递交的第08/164303号专利申请的后续申请，后者全文引入本文以供参考。

1.发明领域

本发明涉及分子遗传学领域。具体地说它涉及向活的、培养的真核细胞中引入特定基因改变的核酸化合物及其应用。更具体地说，它主要涉及基本上Watson-Crick配对的双链核酸，其中双链中的一条链的部分包含含2′-O或2′-OMe核糖的核苷酸，剩余部分包含脱氧核糖核苷酸。

2.发明背景

2.1.嵌合和/或杂种双链核酸

本发明领域涉及核酸。核酸是杂聚物，即不同亚单位的聚合物，亚单位是通过定向的磷酸二酯键或其衍生物连接形成聚合物。双链核酸是这样的核酸，按照尿嘧啶或胸腺嘧啶与腺嘌呤对应和胞嘧啶与鸟嘌呤对应的原则，双链中第一链的每一碱基对应于第二链的碱基。据说拥有这种对应性的逆平行双链是Watson-Crick配对的。双链核酸可有两种主要类型：核糖核酸和脱氧核糖核酸。每种核糖核苷酸都有相应的脱氧核糖核苷酸，例如，腺嘌呤和脱氧腺嘌呤，胞嘧啶和脱氧胞嘧啶，鸟嘌呤和脱氧鸟嘌呤，尿嘧啶和胸腺嘧啶。如本领域中所用的那样，在同一链中存在核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的核酸被称为混合或嵌合(下文称“嵌合”)核酸。其中脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸相互对应的双链核酸被称为杂种双链(hybrid-duplex)。当两条链形成少于其全部碱基的双链核酸区时，所形成的分子被称为异形双链(heteroduplex)。

更经常地，双链核酸的两条链是非共价键合的，而仅通过Watson-Crick配对相连。然而，双链的两条链可通过寡核苷酸连接形成单一聚合物(single polymer)。连接寡核苷酸不是Watson-Crick配对的。其中第一链和第二链是单一聚合物的部分的异形双链被称为“发夹双链”或“柱和环”结构。本文采用前一种名称。

本文所用嵌合现象是核酸聚合物的一种特性，而杂种现象则是双链的一种特性。例如，mRNA及其模板形成杂种双链，但二者都是非嵌合的，然而例如嵌合的八核苷酸5′d(TTTT)-r(CCCC)3′和5′r(GGGG)-d(AAAA)3′相互形成沃森-克里克规则双链，但生成的双链是非杂种双链。下文称非杂种双链的双链核酸为“同质双链”(homo-duplex)。除非另外特别说明，同质双链仅指包含脱氧核苷酸的双链。最后，值得注意的是本领域中称沃森-克里克规则双链的形成为“杂交(hybridigation)”，即使其形成的是非杂种双链核酸。

对X射线衍射和二维NMR分析嵌合和/或杂种核酸结构的研究感兴趣的人们已合成了用于此研究的嵌合核酸和杂种双链核酸。参见，例如Salazar，M.等，1994，J.Mol.Biol.241：440-55和Egli，M.等，1993，Biochemistry 32：3221-37(r3d7.d10形式的双链的嵌合杂种双链)；Ban，C.等，1994，J.Mol.Biol.236：275-85(d5r1d4形式的自身互补嵌合杂种双链)；Chou，S.H.，1991，Biochemistry 30：5248-57(d4r4d4形式的自身互补和非自身互补的嵌合杂种双链)。这些双链核酸的互补链彼此是非共价键合的；它们仅通过沃森-克里克规则配对相连。

合成了嵌合核酸的第二组科学家感兴趣于核糖酶(ribozyme)的研究和用途，核糖酶即自身切开或切开其它RNA的RNA分子。Perreault，J.P.等，1990，Nature 344：565；Taylor，N.R.等，1992，Neucleic Acids Research20：4559-65；Shimaya，T.，1993，Nrucleic Acids Research 21：2605。这些研究发现嵌合核糖酶具有活性，并且对核酸酶的消化比RNA核糖酶具有更强的耐受性。嵌合核糖酶是自身互补的，即沃森-克里克规则配对链是共价连接的。在嵌合核糖酶的研究期间合成的化合物不同于上面提到的杂种双链分子，它们被合成用于结构的研究，因为其中的嵌合核糖酶不包括稳定的杂种双链。因而，具有DNA结合臂的嵌合核糖酶与其底物结合，并形成杂种双链。Yang，G.H.等，1990，Biochemistry 29：11156-60。还参见Sawata，S.等，1993，Neucleic Acids Research 21：5656-60；Hendry，P.等，1992，Neucleic Acids Research 20：5737-41；Shimayama，T.，1993，Neucleic Acids Research 21：2605。核糖酶催化RNA底物的切开，杂种双链因此溶解。