[发明专利]生产人胰岛素

权利要求书

1.生产胰岛素的方法包括：

(a)在允许形成正确二硫键的条件下，折叠含胰岛素原的杂种多肽；

(b)使折叠的、二硫键键合的杂种多肽经酶促裂解以产生胰岛素；

(c)纯化胰岛素。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)还包括在约pH8.5-12.0，约4-37℃将杂种多肽保温约1-30小时。

3.根据权利要求2的方法，其中在存在抗坏血酸的条件下进行保温。

4.根据权利要求2的方法，其中pH为11.0-11.25。

5.根据权利要求3的方法，其中pH为11.0-11.25。

6.根据权利要求3的方法，其中在折叠混合物中，抗坏血酸的浓度为每摩尔SH基约2摩尔抗坏血酸。

7.根据权利要求2的方法，其中所述保温时间为约5小时。

8.根据权利要求3的方法，其中所述保温时间为约5小时。

9.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)还包括：

(I)将pH调到约8.8-9.0；和

(ii)在16-37℃用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解杂种多肽30分钟-16小时。

10.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括用DEAE-Sepharose层析和RP-HPLC纯化。

11.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括用超滤和CM-Sepharose层析纯化。

12.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括用DEAE-Sepharose层析和苯基-Sepharose层析。

13.根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69361的质粒pDBAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。

14.根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69363的质粒pλBAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。

15.根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69362的质粒pBAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。

16.根据权利要求1的方法，其中通过处理含编码杂种多肽之DNA的细菌细胞，以便DNA指导所述多肽的表达，从而得到步骤(a)的杂种多肽。

17.根据权利要求16的方法，其中从所述细胞中回收杂种多肽。

18.根据权利要求16的方法，其中所述处理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的条件下发酵。

19.根据权利要求17的方法，其中所述回收包括：

(I)破坏所述细菌细胞的细胞壁或其片段以产生溶胞产物；

(ii)通过离心从溶胞产物中分离细胞内沉淀物；和

(iii)增溶所述沉淀物。

20.含有胰岛素原和与所述胰岛素原的N-末端相连的前导肽的多肽，其中所述多肽被折叠并含有正确的二硫键。

21.根据权利要求20的多肽，其中所述前导肽衍生于CuZnSOD的N-末端。

22.根据权利要求21的多肽，其中所述前导肽含有62个氨基酸，其前为氨基酸Met，其后为Arg残基。

23.根据权利要求20的多肽，其中所述胰岛素原含有通过单Arg残基与胰岛素A链共价相连的胰岛素B链。

24.根据权利要求20的多肽，其中所述胰岛素原含有通过二肽Lys-Arg残基与胰岛素A链共价相连的胰岛素B链。

25.根据权利要求20的多肽，其中前导肽的Cys残基已经被Ser残基所取代。