[发明专利]生产人胰岛素

说明书

这是美国系列申请08/175298，1993年12月29日申请的接续申请。

发明背景

在本发明说明书中，用括号内的阿拉伯数字列出了各种文献。在说明书后，权利要求前可以找到这些参考文献的所有引述。将这些文献公开的所有内容均引入本说明书作为参考以便更全面地描述本发明所涉及的现有技术的状态。

胰岛素是控制葡萄糖代谢所必需的多肽激素，每天施用给患糖尿病的患者，糖尿病是胰岛素供应不足而引起的代谢紊乱。

体内，首先将该激素合成成长前体分子，随后加工成由A和B链组成的其生物活性形式。更详细地说，在内分泌胰腺的β细胞内，将前原胰岛素的基因转录成mRNA前体，然后剪接生产成熟mRNA。将所述mRNA翻译成前原胰岛素(NH₂-前区-B链-C肽-A链-COOH)，接着再加工成胰岛素原并最终加工成胰岛素。该过程的第一步就是蛋白水解除去前区，该区是通过内质网的微粒体膜来转移新链的疏水信号序列。在人前原胰岛素中，前区的长度是24个氨基酸。

在胰岛素原中，将变成成熟胰岛素的多肽链的两个区，B-和A链通过C肽(或C-链)彼此相连，所述C肽在N和C末端含有两对碱性氨基酸。在大多数C肽中，这些配对是Arg-Arg和Lys-Arg。人C肽，包括两个侧对的碱性氨基酸，含有35个氨基酸。C肽与所述多肽的两个部分相连以便有助于在B和A片段之间形成二硫键。因此，C肽的作用很大程度上不依赖其结构。事实上，用较短的合成桥键代替仍能适当地折叠胰岛素原分子(1，2)。

胰岛素原折叠，同时发生两个链间二硫键和一个A链二硫键的氧化。在成熟化的最后阶段，蛋白水解酶在碱性氨基酸处裂解以释放C肽并形成成熟胰岛素(3)。在人胰岛素中，A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。

世界上每年胰岛素的需求超过数吨，而且严重供不应求。传统上，胰岛素是从有限的动物源中生产的，主要是牛和猪胰腺制品，它们不同于人胰岛素，因此会引发有害的免疫反应。

在六十年代完成的研究表明，可以体外生产胰岛素。通过用其S-磺化形式(4)将A和B链结合或通过自发再氧化还原的胰岛素原(5)来合成胰岛素。后一种方法由于在氧化混合物中蛋白质浓度很低，不能用于大规模生产胰岛素。在用胰蛋白酶和羧肽酶B处理后(6)，可以回收胰岛素。

最近半合成和生物合成的(重组)人胰岛素也可以得到。半合成的人胰岛素是通过胰蛋白酶催化B链30位的Ala换成Thr(是猪胰岛素和人胰岛素之间的唯一不同)而从猪胰岛素生产的。在大肠杆菌或酵母中生产的重组人胰岛素最终将取代所有其它生产途径。

现在通过两种途径制备半合成重组人胰岛素：在大肠杆菌中分开生产A和B链，然后将其结合在一起(7，8)，或酶促转变在大肠杆菌(1，8)或酵母(2，9)中表达的胰岛素原等多肽。

在大多数情况下，胰岛素原是作为杂种蛋白质而生产的，以细胞内沉淀蛋白质的形式积累。正常纯化所述杂交物，然后用CNBr裂解以释放胰岛素原多肽。后者再通过氧化亚硫酸水解(sulfitolysis)修饰得到胰岛素原S-磺酸盐。然后在还原条件下纯化并折叠胰岛素原S-磺酸盐，得到胰岛素原(8)。通过胰蛋白酶和羧肽酶B(6)的联合作用将胰岛素原转变成胰岛素。

专利公开EP195691(Novo Nordisk A/B)描述了分子式为B-Lys-Arg-A的胰岛素原以及其用于在酵母中制备胰岛素的用途。

专利公开EP196056 B1(Chiron Corp.，)描述了用酵母生产的hSOD-胰岛素原蛋白质。在折叠前，使hSOD-胰岛素原蛋白质经溴化氰裂解和亚硫酸水解。

Hoechst在EPO 379162中描述了可以将’胰岛素前体的错重组体“(即，有不正确或部分不正确分子间二硫键的重组胰岛素产物)不通过亚硫酸水解，而是在有机氧化还原系统的存在的条件下，在含水介质中通过将错重组体与过量硫醇反应而转变成正确的胰岛素产物。在氨基酸或肽基从融合多肽裂解后(化学或酶促)(发生在宿主细胞溶解后)进行源(original)亚硫酸水解(sulfitolysis)步骤，因为然后要将胰岛素前体的6个半胱氨酸转变成其S-磺酸盐。在随后的复性步骤中，通过形成三个正确的二硫键而从所述胰岛素原S-磺酸盐生产天然胰岛素原。在该复性步骤，产生了所谓“错重组体”。

Hoechst在PCT WO 91/03550中还公开了制备含所需蛋白质(如胰岛素原)和“平衡组分”的方法。亚硫酸水解在折叠前完成，而在折叠后，与胰岛素原的C-链同时裂解掉“平衡组分”。