[发明专利]狂犬病毒疫苗病毒提纯方法

说明书

狂犬病毒疫苗病毒提纯方法属于狂犬病病毒抗原医用配制品的制备技术领域。

狂犬病是严重危胁人畜健康的一种传染疾病。其防治药品仍为狂犬疫苗。目前，国内外所采用的是未经提纯病毒的细胞培养疫苗，它的最原始的生产方法为羊脑增殖病毒，较为先进的方法是利用人二倍体细胞和绿猴肾细胞生产狂犬疫苗。70年代，我国研制的地鼠肾细胞培养生产狂犬疫苗已取代了羊脑疫苗。但是用细胞培养狂犬疫苗，在生产工艺上存在以下缺陷：(1)疫苗不纯，含有细胞碎片，这些碎片系人体的异性蛋白，它会导致人体局部或全身变态反应。(2)效价低，以上两指标均未能达到WHO(世界卫生组织)所规定的2.5iu(国际单位)/ml(毫升)，所以只能以2ml的含量代之(3)被注射者疼痛感明显，重者有变态反应最近，生物制品单位亦提出研制高纯度的病毒疫苗，其路线是用超速离心技术，但由于这种装置价格昂贵；使用寿命短；产出投入比低而未能实现检索亦未发现与本内容相同的发明曾向中国专利局提出过申请。

本发明的目的在于为医用提供一种纯度高，效价高，能达到世界卫生组织规定的标准，安全可靠的狂犬病毒疫苗制品的原材料，要求保护的技术方案如下：

狂犬病毒提纯方法的设计构思是反复和交替使用离心处理、调PH值和洗脱的方法，并通过紫外分光光度计检测，取得病毒峰值液。其方法是将经检定合格(即无菌，LD₅₀达到10³～10⁴以上)的狂犬病毒细胞液经离心处理，弃细胞，取狂犬病毒液；以醋酸调其PH值，经摇匀并在低温中静止；再经离心处理，除上清；取沉淀病毒，加EDTA溶液，使之悬浮；再调其PH值；经离心处理，弃沉淀；将病毒液上样层析柱上，并用缓冲液洗脱；经检测取出狂犬病毒峰值液。完成狂犬病毒疫苗病毒的提纯过程。

下面就狂犬病毒疫苗病毒的一种提纯方法的具体工艺过程，对本发明作进一步地的说明。

1、取无菌的LD₅₀达10³～10⁴以上的狂犬病毒细胞培养液为原材料。

2、弃细胞离心处理。将无菌的LD₅₀达到10³～10⁴以上的狂犬病毒细胞培养液，以1000×g20分种离心处理，弃细胞，取上清，即狂犬病毒液。

3、用醋酸调PH值。将所取得的狂犬病毒液用醋酸将其PH值调到6.7。

4、摇匀静止。用机械或人工方法，将调定到上述PH值培养液摇匀，再将之放于4℃的环境中，静止20分钟。

5、弃培养液离心处理，将静止后的病毒培养液经1000×g40分钟离心处理，取出沉淀的狂犬病毒。

6、用Tris调PH值。在沉淀的狂犬病毒中加入EDTA溶液，使之悬浮，再用Tris将其PH值调到7.8。

7、弃杂质沉淀离心处理，将调好PH值的狂犬病毒溶液经1000×g20分钟离心处理，弃杂质沉淀，取上清，即狂犬病毒溶液。

8、洗脱。将上述狂犬病毒溶液上样至用NT缓冲液(PH7.8)平衡好的Sephade×G75柱上，用NT缓冲液洗脱，其流速为1毫升/分。

9、检测与收集病毒，利用紫外分光光度计对平衡好的Sephade×G75柱上洗脱的病毒液进行检测，收集和合并病毒峰，即完成提纯工艺过程。

10、灭活。将收集到的狂犬病毒液加入1/4000～1/5000甲醛，再放入37℃恒温室内，静止或旋转24～34小时，即完成灭活过程。

11、检定。可采用INH方法对经灭活的狂犬病毒液进行无菌试验、毒力试验、安全试验和效力试验后即成为狂犬病毒疫苗制品。

图1是狂犬病毒疫苗病毒提纯方法工艺流程图。

本发明与背景技术相比，具有以下的有益的效果：(1)提高了病毒的纯度，用本方法所提纯的狂犬病毒不仅纯净，且达到了电子显微镜检查纯和血清学双扩散纯的标准，并呈现一条病毒带。(2)效价可以超过2.5iu/ml的指标。达到或优于WHO(世界卫生组织)所规定的标准。(3)安全可靠，这是提高了纯度和效价的必然结果。