[发明专利]Ｌ－苯丙氨酸甲酯和Ｎ－苄氧羰基－天冬氨酸的酶催偶合

说明书

本发明涉及一种制备N-苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，该方法利用N-苄氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在水介质中发生高转化率的酶催偶合，同时形成沉淀。

N-保护的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，特别是例如N-苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，是“强力甜味剂”天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的重要前体，这种甜味剂是甜度约为蔗糖的200倍的一种产品，具有优良的味型，没有其它甜味剂(例如糖精和环己烷氨基磺酸盐)那种发苦的后味。甜味剂天冬氨酰苯丙氨酸甲酯用在许多种产品中，例如软饮料、糖果、餐桌甜味剂、药物等。

已知有各种制备天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的方法。除了化学制备方法以外，还有酶催制备法，酶催制备法的重要性主要在于酶催偶合以立体选择性和区域选择性的方式进行。至今已经对N-保护的天冬氨酸(特别是N-苄氧羰基天冬氨酸，以后还称作Z-Asp)和L-(或DL-)苯丙氨酸甲酯之间，或者由它们衍生的酸式盐(例如盐酸盐，以后也用PM表示)之间形成N-保护的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前体的酶催L,L-偶合作了充分的研究和描叙。K.Oyama在“工业中的手性”(Chiralityin Industry,John Wiley & Sons公司，1992)一书的第11章(237-247页)对天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的制备方法作了评论。

上述的酶催偶合反应是一种平衡控制的反应，它通常在6-7.5的pH下和一种中性蛋白酶(特别是金属蛋白酶，例如嗜热菌蛋白酶)存在下进行。为了在这类酶催偶合反应中实现高转化率，按照现有工艺必须采取特别措施。例如，US-A-4165311(它被认为代表了最新工艺水平)利用了下述事实：通过N-保护的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，特别是N-苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(以后也称作Z-APM)，与反应混合物中存在的D-或L-苯丙氨酸甲酯形成沉淀的加成化合物，可以将偶合反应的平衡移向右方。天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前体的这些加成化合物还分别称作Z.APM.D-PM或Z.APM.L-PM。为了形成这种加成产物，根据现有的工艺，对于Z-Asp和L-PM的偶合反应最好是Z-Asp与至少两倍摩尔数量的L-PM反应，或者是在有至少相当数量的D-PM存在下反应，以便达到高的转化率，即，按Z-Asp计转化率≥60％，优选≥80％。实际上，这些酶催偶合反应因此常用PM对Z-Asp之比来描述，例如此比例为2.0至2.5∶1或更高。虽然用这种实施方案确实达到了所要产物的高转化率，但是这些方法有一些缺点，即：

(a)为得到最终要求的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(以下称作APM)而要作的处理和进一步的加工很麻烦，部分原因是该加成产物较难过滤，而为了得到只含少量杂质的APM必须洗彻底；

(b)必须将过量存在的组分和从偶合产物的沉淀加成产物中释放出的非APM组分回收和/或再循环；如果偶合反应是与DL-PM进行，则剩余的D-PM在加工时通常也应被外消旋化，一般是利用DL-苯丙氨酸。因此这些方法不太适合在工业规模上应用。

应当指出，WO-A-92/02617叙述了基本上等量的Z-Asp和L-PM.HCL(摩尔比约为1.2∶1)在水介质中和乙酸存在下(pH=7)的酶催偶合反应。在这种情况下，使用了通过交联而固定的蛋白酶晶体，但是所达到的转化率只有20％。EP-A-0149594介绍了利用甲酰-Asp(F-Asp)以1∶1的F-Asp∶L-PM比在水介质中进行酶催偶合反应。但是，因为形成了F-APM·L-PM加成产物，该F-Asp的转化率明显地仍低于50％，发现此过程达到的产率很低(在加工得到F-APM后约为12％)。

同样方式，Zhou F.等(化学反应工程与工艺，1992,8(4),413-419页，中文；化学文摘120(NO.35),31-1-94，文摘48817V)也在其中叙述了Z-L-Asp和L-PM在初始pH 6下进行1∶1酶催偶合的试验。但是，由于通常会形成Z-APM·PM加成产物，在这些条件下的Z-Asp的转化率至多也不过是46.1％。应该指出，Zhou F.等人报道的L-PM转化率(最高92.2％)将化学偶合到Z-APM中的L-PM和与Z-APM同时沉淀的一当量L-PM加在一起考虑。该文章没有提到L-PM的化学转化率能达到50％以上。