[发明专利]一种制造重组人粒－巨噬细胞集落刺激因子的方法

说明书

本发明涉及一种利用基因工程技术制造重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的方法，它包括以下几个步骤：

1.利用PCR方法对GM-CSF cDNA进行改构；

2.在大肠杆菌中进行高效表达；

3.表达产物的复性；

4.复性后表达产物的纯化。

在以往的研究中(Greenberg R，Curr.Microbiol，1988；17：321)，天然的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在大肠杆菌中表达量很低，难以复性、纯化，不易达到临床应用的要求，成本昂贵，不利于大量生产应用。

本发明的目的在于避免上述现有技术不足，提高GM-CSF在大肠杆菌中的表达水平，降低成本利于大量生产而提供的改构cDNA和GM-CSF的复性、纯化的方法。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

利用计算机模拟改造GM-CSF cDNA成熟编码区的5′端，使其形成的二级结构减弱，能量下降减少，有利于mRNA的解读、翻译，提高表达量。根据此设计合成引物，用PCR方法定向改造cDNA成熟编码区的5′端，尽量采用大肠杆菌偏性密码子，而不改变编码氨基酸排列的顺序。

改构后的cDNA插入到pBV220表达载体中，转化受体菌HB101，经热诱导后，高效表达rhGM-CSF。表达的rhGM-CSF工程菌用超声破碎，经4,000～12,000rpm离心15～25分钟后取包含体沉淀，用含有0～2M尿素、10～50mM Tris-HCl或磷酸盐缓冲液(pH8～9)洗涤；洗涤后包含体沉淀用8M尿素、10mM二硫苏糖醇(DTT)溶解，可溶部分用由二硫苏糖醇0.01～2mM、氧化型谷胱甘肽0.01～2mM组成的稀释复性液在2～10℃温度下复性。

复性后经Q-Sepharose FF层析柱纯化，洗脱液为含有0.3～1M NaCl的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液(pH6.5～8.5)。收集蛋白峰过Sephacryl S-200柱除去多聚体，即得rhGM-CSF纯品。

另一纯化路线亦可得到相同结果：8M尿素可溶部分先过Sephacryl S-200层析柱，部分收集rhGM-CSF蛋白峰，在上述稀释复性液中复性，再过Q-Sepharose FF层析柱。

附图的图面说明如下：

图1.改构后的rhGM-CSF cDNA序列

图2.改构后的rhGM-CSF cDNA序列

图3.rhGM-CSF重组质粒构建图。其中：

1.pUC/GM-CSF

2.GM-CSF cDNA

3.pBV220

4.改构后的GM-CSF cDNA

5.重组质粒J1

本发明结合附图实施例作进一步详述：

实施例1：根据文献发表的cDNA核甘酸顺序，设计并合成引物。从中国人外周血有核细胞中提取总RNA，用逆转录-PCR扩增克隆了hGM-CSF之cDNA，用DNA序列分析验证。再根据大肠杆菌偏性密码及能量最低原理，设计合成一对引物，尽量避免cDNA成熟编码区5′端的二级结构，将终止密码子换成TAA。引物如下：

上游引物：5′CGGAATTCATGGCACCAGCACGTTCTCCATCTCCGTCTACTCAGCCCTGG3′；

下游引物：5′CTGGATCCTTACTCCTGGACTGGCTC3′。

用PCR方法改构cDNA(如图1)，以EcoR I和BamH I位点插入高效表达载体pBV220中(构建过程见图3)，转化受体菌HB101，筛选出重组质粒，命名为J1。

将工程菌J1/HB101接种于LB液体培养基中，30℃培养过夜，再以5％扩大培养至对数生长中期，立即转42℃继续培养4小时。4,500rpm离心25分钟收集菌体，以1/10悬浮于20mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，12,000rpm离心15分钟，收集包含体沉淀，用1M尿素洗涤沉淀两次，离心回收沉淀，用8M尿素10mM DTT溶解。可溶部分过凝胶过滤Sephacryl S-200层析柱，缓冲液为20mM Tris-HCl(pH8.0，含5M尿素)，分步收集rhGM-CSF峰，用含0.2mM DTT和0.1mM氧化型谷胱苷肽的缓冲液复性后过Q-Sepharose FF阴离子交换柱，用含1M NaCl的20mM Tris-HClpH8.0洗脱rhGM-CSF，其比活性＞1×10⁷u/mg，纯度＞98％。