[发明专利]沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针及其应用方法

说明书

本发明涉及分子生物学，具体地说就是一种用于检验沙门氏菌的生物探针，它可以直接应用于食品卫生检验，环境检测、海关检疫及医学临床中的沙门氏菌检验。

属沙门氏菌的菌种繁多，迄今已发现2000种以上是常见的致病菌。沙门氏菌检验是食品卫生和环境检疫的必检项目，目前，我国卫生部颁布的沙门氏菌检验方法，主要是根据沙门氏菌的形态，生理生化特征以及血清反应来检验定型，其过程复杂、操作繁烦，周期长，并且易与其相接近的细菌发生交叉反应而影响准确性。在现有沙门氏菌检验方法中甚至还要使用剧毒试剂(氢化钾)，对工作人员健康有危害。

迄今为止，中国尚未有任何有关沙门氏菌核酸分子探针的研究和专利发表，但是国际上发达国家都已投入大量资金和人力开展沙门氏菌新的检验方法和核酸分子探针的研制。在rDNA核酸分子探针中包括rRNA编码区探针和非RNA编码区探针两类不同的探针。在美国专利VS5147778中公开了一种沙门氏菌rDNA探针，它以rRNA或rDNA中rRNA编码区序列为探测的目标基因，虽然它建立了一种快速、无毒的沙门氏菌的检验方法，但是灵敏度仍不够高。而寻找专一性更高的探测目标，难度很大，研制探针的难度就更大。美国、日本等研究人员都正在向这一方向发展。但目前，国内外都没有任何有关的研究报道。

本发明的目的在于克服背景技术存在的不足之处，把以核酸分子探针为基础的基因检测和鉴定技术应用于沙门氏菌的检验，研制出一种专一性更高的核酸分子探针及其应用方法。由此建立一种快速、准确、无毒又具有高灵敏度的沙门氏菌检验新方法。

一种沙门氏菌核酸分子探针，其特征在于以沙门氏菌rDNA中非RNA编码区作探测目标基因，设计沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，其结构是由23个核苷酸组成，它的核苷酸序列如下：5＇CGAAGCATACATCAGTATGTTAG 3＇。

rRNA及其基因rDNA是研制沙门氏菌核酸分子探针的一个很好的目标基因，在rDNA中存在着rRNA编码区和非RNA编码区(即间隔区)，rRNA序列和rDNA中rRNA编码区序列可以被用来研制沙门氏菌rRNA探针和rDNA探针，而rDNA中非RNA编码区则可用来研制沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针。

细菌rDNA间隔区是一个高变区，不同细菌类群的rDNA间隔区结构差别很大，这种差别还可以反映不同细菌之间亲缘关系的远近(即亲缘关系越远，差别越大，反之亦然)。在rDNA间隔区中，存在沙门氏菌与其它非沙门氏菌完全不同的核苷酸序列，即沙门氏菌特征核苷酸序列，根据该特征序列建立起的沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，具有极高的沙门氏菌专一性。该探针能与沙门氏菌DNA发生专一性反应，但不与其它的非沙门氏菌DNA发生交叉反应，所以可以用于沙门氏菌的鉴定和样品中沙门氏菌的检验。

建立沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，首先要对沙门氏菌rDNA间隔子进行分子克隆和DNA序列测定，并且对沙门氏菌属中不同的菌种分别加以考察，最后根据DNA序列测定和分析的结果，设计和合成沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，该探针可以分子杂交或者PCR的方式对待测样品加以检验，如存在沙门氏菌，就出现阳性标志，如无沙门氏菌，则出现阴性标志。

根据发明人已测定的沙门氏菌rDNA间隔子核苷酸序列，并与已公开发表的其它非沙门氏菌rDNA序列数据相比较。本发明选择了五组9种沙门氏菌用于研制沙门氏菌rDNA间隔子核苷酸分子探针。这五组9种沙门氏菌，菌种均来源于广州市防疫站致病菌室，它们的中文及拉丁文名称如下：

甲(A)组：

甲型副伤寒沙门氏菌    (Salmonella paratyphi A)

乙(B)组：

乙型副伤寒沙门氏菌    (S.paratyphi B)

鼠伤寒沙门氏菌        (S.typhi murium)

丙(C1)组：

丙型副伤寒沙门氏菌    (S.paratyphi C)

田纳西沙门氏菌        (S.tennessee)

丁(D)组：

伤寒沙门氏菌          (S.typhi)

肠炎沙门氏菌          (S.enteritidis)

戊(E1)组：

鸭沙门氏菌            (S.anatum)

韦太夫雷登沙门氏菌    (S.weltevreden)