[发明专利]乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法和应用

权利要求书

1.乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于：选用乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂，酶促反应的反应物由缓冲液、底物和辅酶配制而成，反应过程表达为：

测定反应体系中不含被筛选物的酶促反应速率V0和反应体系中加入被筛选物后的酶促反应速率V1，根据二者比值，确定抑制活性百分数i％，其公式为： i % = ( 1 - V 1 V 0 ) × 100 % - - - ( 1 ) ]]>反应速率V可用测定酶活即随时间而变化的产物的增加量代表，用E表示，则公式(1)成为： i % = ( 1 - E 1 E 0 ) × 100 % - - - ( 2 ) ]]>根据测定的E值，计算出被筛选物的抑制活性i％，根据抑制活性i％判断是否为抑制剂及抑制剂的优劣，就可筛选出抑制剂，其筛选过程包括以下步骤：

(1).首先选用比活值5-12μm/mg·hr，体积为0.2-0.5ml的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂；

(2).确定能完全溶解被筛选物的一种溶剂，并配制成浓度为2mg/ml的溶液；

(3).确定进行酶促反应的反应物所含缓冲液、底物和辅酶的组成及在反应体系中的浓度如下：

缓冲液：磷酸氢二钾K₂HPO₄ 20mM

底  物：丙酮酸钠CH₃·CO·COOH 15.5mM

辅  酶：氯化镁MgCl₂ 0.4mM

        硫胺素焦磷酸TPP 0.4mM

        黄素腺嘌呤双核苷酸FAD 8μM

(4).在四个试管中，分别先加入0.5ml的酶和0.6ml 20mM的K₂HPO₄，再按以下四种情况(I，II，III，IV)加入或不加入溶剂，被筛选物溶液，反应物及适量的H₂O，配制成2.6ml的反应溶液体系，该体系的PH值为6.9-7.5，在常压，39-40℃，进行1小时酶促反应，生成产物乙酰乳酸，表达式如下：

按以下四种情况分别测出产物量E值：

在反应体系中加入溶解被筛选物的溶剂0.1ml而不加被筛选物时：

I.测定反应体系中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA；

II.测定反应体系中加入1ml反应物后的酶促反应产物量EB；

在反应体系中加入0.1ml被筛选物溶液时：

III.测定反应体系中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA1；

IV.测定反应体系中加入1ml反应物后的酶促反应产物量EB1；

(5).确定乙酰乳酸合成酶的活性E0，该活性等于加入反应物后的酶促反应产物量EB与没有反应物量EA之差，该值表达式：

                   E0＝EB-EA

(6).确定乙酰乳酸合成酶在有被筛选物存在时的活性E1，该活性等于加入反应物后的酶促反应产物量EB1与没有反应物时的酶促反应产物量EA1之差，该值表达式：

                   E1＝EB1-EA1

(7)根据权利要求1中的公式(2)，计算被筛选物的抑制活性，酶活性测定选用分光光度法，系测定产物乙酰乳酸在硫酸作用下转化为3-羟基丁酮的含量，反应过程表达为：分光光度法测E值依次包括如下步骤：

①.向2.6ml的酶促反应溶液体系中加入0.05-0.25ml，6N的H₂SO₄；

②.将上述溶液在59-60℃下恒温15分钟；

③.加入0.5-1.5ml，0.5％的肌酸；

④.再加入1-2ml，5％的1-碱萘酚，生成红色络合物；

⑤.测定溶液体积为3-7ml；在59-60℃，常压下恒温20分钟；

⑥.取出溶液，摇匀后室温放置30-40分钟；

⑦.用分光光度仪测定E值，波长为520nm，1cm比色皿。